枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析
Summary
例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。
Abstract
マイクロ流体技術は、微生物学の伝統的な分析手法を制限の多くを克服します。単一セルの解像度との世代の数百に及ぶ時間長い観察併設して大量培養方法とは異なりアガロース パッドを用いた顕微鏡とは異なり厳密に管理することができる均一な生育条件があります。成長媒体の連続的な流れを分離細胞の増殖と代謝、増殖への応答と遺伝子発現の本格的な変化によって引き起こされるローカル化学環境で予測不可能な変化からマイクロ流体デバイスの細胞をから特定の刺激より自信を持って観察できます。枯草を使用ここでは「マザーマシン」を示すモデルの菌種として-細胞解析法を入力します。構築しマイクロ流体デバイスを垂直、細胞でそれをロード、顕微鏡イメージングを開始、1 つの成長媒体から別に切り替えることによって刺激する細胞を公開する方法を示します。ストレス応答の記者は、このメソッドによって得られるデータの種類を明らかにするための例として使用されます。我々 も簡単にさらに実験、細菌の胞子形成の分析などの他の種類のこのメソッドのアプリケーションを議論します。
Introduction
地球上の生命の最も顕著な特徴の 1 つは、偉大な回復力と様々 な。分子生物学の中心的な目標は、細胞の遺伝子そして蛋白質を最大限に使用彼らの成長とさまざまな環境条件下でフィットネス ロジックを理解します。この目標を達成するために科学者が、自信を持ってを確認できる必要がありますどのように個々 の細胞は、成長、分類し、特定の条件セットの下で彼らの遺伝子を表現、細胞がその後の環境の変化に反応する方法注意すること。しかし、微生物学の従来の分析方法は対処できる質問の種類に影響を与える技術的な限界にあります。たとえば、一括文化に基づく分析は長年にわたって非常に有用されているまだ意味のある細胞に変化または総人口の細胞の小さいサブ集団の行動を隠すことができる人口レベルのデータのみを提供します。光顕的観察に基づく生きた細菌の単一細胞解析は単一細胞の挙動を明らかにするも技術的に限られています。細菌成長培地を含む agarose パッドに固定されている通常細胞の成長と分裂の群衆ミクロな視点、、観測時刻1を実質的に制限するちょうど少数の細胞周期後利用できる栄養素を使い果たす 2。さらに、ローカル栄養素の枯渇と細胞増殖による代謝副産物の併用の蓄積は常に測定や予測が難しい方法でローカル セル成長環境を変化します。アガロースのパッドを使用してこのような環境変化の定常状態の動作または成長条件3の特定の変化に対する細胞応答の研究に課題があります。
マイクロ流体技術、微細加工素子を液体培地が継続的に受け渡される古典的な実験的限界への解決策を提供しています。マイクロ流体デバイスを成長媒体の流れは常に新鮮な栄養素と細胞を提供する、均一な成長を作成することにより、余分な細胞と代謝副産物を洗い流しながら、生細胞の顕微鏡検査のための位置に個々 の細胞を保つことができます。環境。一定の成長条件の下で細胞の挙動は細胞の内部ロジックの妨げられていないビューを許可する環境要因の影響から分離して観察できます。流体の流れは、マイクロ流体デバイスを防止細胞と混雑になっているから、数十または数百の世代のための単一細胞系譜の観察可能な4,5になります。このような長い観測時間は、そうでなければ検出できない長期的またはまれな細胞挙動の検出を許可します。最後に、デバイスを流れることができます変更する培地の組成は、細胞ストレスの発症に、導入、または特定の化合物の除去に対応する、観察することができます。
マイクロは、重要なアプリケーションの数をすでに楽しんでいます。例えば、それは組織、器官、または種類の人間の細胞は、生体内での条件6をシミュレートするために共培養体オンチップ デバイスで使用されています微細環境7の線虫の動きの研究のため細菌バイオ フィルム (例えば、 8); 間の相互作用を調べるしてカプセル化と細胞や化学物質 (例えば、 9) の小さなボリュームの操作。マイクロ流体デバイスが物理として特に (優秀なレビューを参照してください10および11) の微生物学の分野でますます人気のあるもになるし、流動性が自然微生物ニッチ12に似合い。例えば、マイクロ流体最近として採用されている微生物によってそのような目的の細胞成長と分裂13,14,15、病原体の動き16の分析を正確に測定監視クォーラム センシング17および生理学的転移18とタンパク質19、他の多くの例の中で数をカウントします。ここで紹介した方法の系統や種の組み合わせではなく、単一の細菌細胞系譜の解析設計されます。ここに示すマイクロ流体デバイスを利用して「マザーマシン」デザインの4細胞が単一ファイルを栽培されて 1 つのバリエーション 1 つクローズド エンドと 1 つのオープン エンド; マイクロ トレンチ内オープン エンドのうち上下にプッシュ子孫細胞成長と分裂をセル流体の流れにします。私たちの分析は、通常、海溝のクローズド エンドに限られている「母」のセルだけに集中します。我々 は以前光顕微鏡ベース単一細胞解析技術、アガロース パッドの細胞固定化などで進歩としてこのメソッドを考慮します。メソッドは他の細菌種に適用もここでモデルとして使用されますが、枯草(大腸菌は別の共通モデル; 異なるセルのサイズや形態のいくつかの種は、新しいデバイスの作製を必要があります異なる寸法)。細胞をマークし、遺伝子発現の変化を可視化する蛍光レポーターの使用遺伝子扱いやすい種の使用が必要です。しかし、細胞の増殖と形態の解析に蛍光マーカーがなくても対応可能です。
現在のプロトコルを除く5; 写真平版は、他の場所で広範囲にわたって記載されているを使用してシリコン マスターを製造する工程マスターズは、微細加工設備から簡単に外部委託も可能です。強化シリコン マスターから PDMS デバイスの成形が含まれていますカバー ガラスの部分にデバイスのボンディングマイクロ流体の入口と出口の配管の組み立て、含むピンチ弁中程度の切り替えを許可するにはデバイスを不動態化、細菌のセルの準備および細菌細胞とデバイスの読み込み配管をデバイスに接続して, 細胞;蛍光顕微鏡イメージングのためにデバイスを読み込みます。多くの別の画像集録および処理ソフトウェア ツールを使用して視覚化および金利4、5のさまざまなデータを分析することができます、例の画像を表示し、画像キャプチャ方法はこのプロトコルには含まれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
このマイクロ プロトコルは柔軟性手順の多くは、特定の種やひずみ、あるいは特定の目的のための使用を最適化するために変更する場合があります。確かに、このプロトコルでは我々 は枯草と使用を最適化するために元の「マザーマシン」コンセプト4に変更を加えました。多くの場合、セルの限定トレンチはこのプロトコルでセルを囲む浅いチャネルと 2 層セル ト…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、GM018568 の下で健康の国民の協会によって賄われていた。このプロトコルで行われた一部中心ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているの。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。多くのおかげでは、妊娠とここと装置の元のバージョンのビルドに示されるデバイスに使用されるマスター テンプレートを加工で自分の仕事のトーマス ・ ノーマンとネイサンの主原因です。また、ヨハン ・ アンデルセンと彼の貴重なコラボレーション アドバイスをありがとう、彼らのアドバイスや細菌マイクロ流体装置の継続的な改善の彼の研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
