Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands
Summary
Complexité des systèmes de in vivo , il est difficile de distinguer entre l’activation et inhibition du récepteur Notch par trans– et cis-ligands, respectivement. Nous présentons ici un protocole basé sur in vitro tests cellulaires-agrégation pour évaluation qualitative et semi quantitative de la liaison de l’encoche de la drosophile à trans-ligands vs cis-ligands.
Abstract
La signalisation Notch est un système de communication de cellules évolutivement conservés utilisé largement en développement animal et entretien adulte. Interaction des récepteurs Notch avec des ligands de cellules voisines induit l’activation de la voie de signalisation (trans-activation), tandis que l’interaction avec les ligands de la même cellule inhibe la signalisation (cis-inhibition). Juste équilibre entre trans-activation et cis-inhibition permet d’établir des niveaux optimaux de la signalisation Notch dans certains contextes au cours du développement animal. En raison des domaines d’expression qui se chevauchent de Notch et ses ligands dans plusieurs types de cellules et de l’existence de mécanismes de rétroaction, étudier les effets d’une modification post-traductionnelle donnée sur trans– et cis-interaction de la protéine Notch et ses ligands in vivo est difficile. Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation de cellules S2 Drosophila lors d’essais de la cellule-agrégation d’évaluer les effets de faire tomber un modificateur de parcours de Notch sur la liaison de la protéine Notch à chaque ligand dans trans et cis. Cellules S2 stablement ou transitoirement transfectées avec un vecteur exprimant l’encoche sont mélangés avec les cellules exprimant chaque ligand de Notch (S2-Delta ou S2-Serrate). TRANS-liaison entre les récepteurs et ligands se traduit par la formation d’agrégats cellulaires hétérotypiques et est mesurée en termes de nombre d’agrégats par mL composé de > 6 cellules. D’examiner l’effet inhibiteur du cis-ligands, S2 cellules exprimant conjointement Notch et chaque ligand sont mélangées avec des cellules S2-Delta ou S2-Serrate et le nombre d’agrégats est quantifié comme décrit ci-dessus. La diminution relative du nombre d’agrégats en raison de la présence de cis-ligands fournit une mesure de cis-ligand-médiée par l’inhibition de la trans-liaison. Ces tests simples peuvent fournir des données semi-quantitatives sur les effets des manipulations génétiques ou pharmacologiques sur la liaison de la protéine Notch à ses ligands et peuvent aider à déchiffrer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des ces manipulations sur la signalisation Notch.
Introduction
La signalisation Notch canonique est un mécanisme de communication de cellule à cellule à courte portée qui nécessite un contact physique des cellules pour faciliter l’interaction entre les récepteurs Notch et leurs ligands1voisines. Interaction des récepteurs Notch (présent sur la surface des cellules de récepteur de signal) avec des ligands (présentes à la surface de l’envoi de signal cellules) initie la signalisation Notch et est connu comme trans-activation2. En revanche, l’interaction entre l’encoche et ses ligands dans la même cellule entraîne l’inhibition de la voie Notch et est connue comme cis-inhibition3. L’équilibre entre trans– et cis-interactions est nécessaire pour assurer optimale ligand-dépendants encoche4de signalisation. Drosophile a un récepteur de Notch et deux ligands (Delta et Serrate) par opposition à des mammifères, qui ont quatre récepteurs Notch et cinq ligands [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 et DLL4]5. Cette simplicité, le modèle drosophile offre la facilité pour disséquer/étude des effets de modificateurs de la voie sur les interactions ligand-Notch et par la suite sur la signalisation Notch. Dans certains contextes au cours du développement animal (notamment le développement de l’aile chez la drosophile), les cis– et trans-interactions interviennent pour réaliser la signalisation Notch appropriée et cellule sort1,6 . Il est important de distinguer les effets des modificateurs de parcours de Notch dans ces contextes sur cis– et trans-interaction de la protéine Notch avec ses ligands.
Notre groupe a déjà rapporté qu’addition d’un résidu d’hydrate de carbone appelé xylose Drosophila Notch à négativement régule la signalisation Notch dans certains contextes, y compris le développement aile7. Perte de shams (l’enzyme qui xylosylates Notch) mène à un phénotype de « perte de la veine de l’aile »7. Plus récemment, des expériences de dosage génique et analyse clonale servaient à montrer que perte de shams améliore l’encoche Delta-mediated singulariser. De distinguer si la signalisation d’encoche renforcée chez les mutants shams est le résultat d’une diminution de cis-inhibition ou accru trans-activation, études de surexpression ectopique de ligands Notch dans les disques imaginaux de larves aile l’utilisation du pilote de la dpp-GAL4 ont été effectuées. Ces expériences fourni de preuve suggérant que Shams régule trans-activation de la protéine Notch par Delta sans affecter l’encoche cis-inhibition par des ligands8. Cependant, informations en retour règlement et effets de ligands endogènes pourraient compliquer l’interprétation des études de surexpression ectopique1,6,9.
Pour résoudre ce problème, Drosophila S2 cellules10 ont été utilisées, qui prévoit un système simple en vitro Notch-ligand interaction études11,12. Cellules S2 ne pas exprimer endogène récepteurs Notch et Delta ligand11 et exprimer un faible niveau de Serrate13, qui n’affecte pas l’encoche-ligand agrégation expériences8. Donc, S2 cellules peuvent être stablement ou transitoirement transfectées par encoche et/ou différents ligands (Delta ou Serrate) pour générer des cellules qui expriment exclusivement les récepteurs Notch ou l’un de ses ligands ou une combinaison d’entre eux. Mélange de cellules exprimant l’encoche S2 avec exprimant le ligand S2 cellules entraîne la formation d’agrégats hétérotypiques médiée par le récepteur-ligand liaison11,12,14. Quantification de la formation globale fournit une mesure de trans-liaison entre l’encoche et ses ligands15 (Figure 1). De même, les cellules S2 peuvent être co transfectées avec des ligands Notch et Delta ou Serrate (c.-à-d. cis-ligands). CIS-ligands dans ces cellules exprimant l’encoche S2 abroger la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et résultat dans a diminué de formation total8,12,14. La diminution relative de la formation globale provoquée par cis-ligands fournit une mesure de l’effet inhibiteur du cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-ligands (Figure 2). En conséquence, les essais sur l’agrégation des cellules ont été utilisés pour examiner l’effet de la perte de xylosylation sur trans– et cis-interactions entre l’encoche et ses ligands.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour essais sur l’agrégation des cellules dans le but d’évaluer la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et son inhibition par cis-ligands à l’aide de cellules S2 de drosophile . À titre d’exemple, nous fournissons les données qui nous ont permis de déterminer l’effet d’entaille xylosylation sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta8. Ces tests simples fournissent une évaluation semi-quantitative de l’encoche-ligand interactions in vitro et aident à déterminer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des modificateurs de parcours de Notch.
Protocol
Representative Results
Discussion
La signalisation Notch canonique dépend des interactions entre le récepteur de Notch et ses ligands5. Bien que la plupart des études sur la voie de l’encoche considèrent surtout la fixation de ligands dans les cellules voisines (trans) et Notch, entaille et même cellule ligands interagissent-elles et ces soi-disant cis-interactions peuvent jouer un rôle inhibiteur dans l’encoche signalisation de3,4. En conséque…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’appui de la NIH/NIGM (R01GM084135 à HJN) et la Fondation Mizutani pour Glycoscience (subvention #110071 à HJN) et sont reconnaissant envers Tom V. Lee pour discussions et suggestions sur les dosages et Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine et la drosophile génomique Resource Center (DGRC) de plasmides et de lignées cellulaires.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
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