Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos
Summary
Complejidad de los sistemas en vivo hace que sea difícil distinguir entre la activación y la inhibición del receptor Notch por trans– y cis-ligandos, respectivamente. Aquí, presentamos un protocolo basado en los análisis agregación celular en vitro para la evaluación cualitativa y semicuantitativa de la Unión de la muesca de la Drosophila a trans-ligandos vs cis-ligandos.
Abstract
Señalización de Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado utilizado ampliamente en el desarrollo de animales y mantenimiento del adulto. Interacción del receptor Notch con ligandos de los vecinos células induce la activación de la vía de señalización (trans-activación), mientras que la interacción con ligandos de la misma célula inhibe la señalización (cis-inhibición). Equilibrio adecuado entre trans-activación y cis-inhibición ayuda a establecer niveles óptimos de señalización Notch en algunos contextos durante el desarrollo animal. Debido a los dominios de expresión superpuestos de la muesca y sus ligandos en muchos tipos celulares y la existencia de mecanismos de retroalimentación, estudiando los efectos de una determinada modificación poste-de translación en trans– y cis-interacciones de la muesca y sus ligandos en vivo es difícil. Aquí, describimos un protocolo para el uso de las células S2 de Drosophila en los ensayos de agregación celular para evaluar los efectos de derribar un modificador de la vía de Notch en la Unión de muesca a cada ligando trans y el cis. S2 las células transfectadas estable o transitorio con un vector de expresión de muesca se mezclan con las células que expresan cada ligando de Notch (serrado S2 o S2-Delta). Trans-unión entre los receptores y ligandos resulta en la formación de agregados celulares heterotípicos y se mide en términos del número de agregados por mL compuesto de > 6 células. Para examinar el efecto inhibitorio de cis-ligandos, S2 las células Co muesca y cada ligando se mezclan con las células Delta del S2 o S2-serrado y se cuantificó el número de agregados como se describió anteriormente. La disminución relativa del número de agregados debido a la presencia de cis-ligandos proporciona una medida de cis-ligand-mediada por la inhibición de la trans-vinculante. Estos ensayos sencillos pueden proporcionar datos semi cuantitativos sobre los efectos de manipulaciones genéticas o farmacológicas en la Unión de ranura a sus ligandos y pueden ayudar a descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de tales manipulaciones sobre la señalización de Notch.
Introduction
Canónica de la señalización de Notch es un mecanismo de comunicación de célula a célula de corto alcance que requiere contacto físico de los vecinos a las células para facilitar la interacción entre receptores Notch y sus ligandos1. Interacción del receptor Notch (presente en la superficie de las células receptores de señal) con ligandos (presentes en la superficie de envío de señal de las células) inicia la señalización de Notch y se conoce como trans-activación2. Por otro lado, la interacción entre muesca y sus ligandos en la célula misma conduce a la inhibición de la vía de Notch y es conocido como cis-inhibición de la3. El equilibrio entre trans– y cis-interacciones es necesaria para asegurar la óptima muesca dependiente de ligando señalización4. Drosophila tiene un receptor Notch y dos ligandos (Delta y serrado) a diferencia de los mamíferos, que tienen cuatro receptores Notch y cinco ligandos [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 y DLL4]5. Esta simplicidad, el modelo de Drosophila ofrece la facilidad para diseccionar y estudio de los efectos de los modificadores vía las interacciones ligando de Notch y posteriormente sobre la señalización de Notch. En ciertos contextos durante el desarrollo animal (incluyendo desarrollo de ala de Drosophila), cis– y trans-interacciones participan para lograr la adecuada señalización Notch y células destino1,6 . Es importante distinguir los efectos de los modificadores de la vía de Notch en estos contextos en cis– y trans-las interacciones de la muesca con sus ligandos.
Nuestro grupo reportó anteriormente que además de un residuo de carbohidrato llamado xilosa a Drosophila muesca negativa regula la señalización de Notch en ciertos contextos, incluyendo ala desarrollo7. Pérdida de shams (la enzima que xylosylates muesca) conduce a un fenotipo de «pérdida de vena del ala»7. Más recientemente, experimentos de dosis génica y análisis clonal fueron utilizados para mostrar que pérdida de shams realza señalar muesca mediada por el Delta. Para distinguir si la señalización de Notch mejorada en shams mutantes es el resultado de la disminución de cis-inhibición o aumento de trans-activación, sobreexpresión ectópico estudios de ligandos de muesca en discos imaginal de ala de larvas se realizaron utilizando el controlador de la dpp-GAL4 . Estos experimentos proporcionan evidencias sugiriendo que Shams regula trans-activación de Notch por Delta sin afectar la muesca cis-inhibición por ligandos8. Sin embargo, retroalimentación normativa y efectos de los ligandos endógenos podrían complicar la interpretación de sobreexpresión ectópico estudios1,6,9.
Para resolver este problema, en células S2 de Drosophila 10 fueron utilizados, que preven un sistema simple en vitro ligando de Notch-interacción estudios11,12. Células S2 no expresar endógenos receptor de la muesca y Delta ligando11 y expresar un bajo nivel de Serrate13, que no afecta el ligando de Notch-agregación experimentos8. Por lo tanto, las células S2 pueden ser estable o transitorio transfected por muesca o ligandos individuales (Delta o serrado) para generar las células que expresan exclusivamente el receptor Notch o uno de sus ligandos o una combinación de ellos. Mezcla de células expresando muesca S2 con resultados de S2 ligand-expresar las células en la formación de agregados heterotípicos mediada por receptor-ligando vinculante11,12,14. Cuantificación de la formación agregada provee una medida de trans-vinculante entre la muesca y sus ligandos15 (figura 1). Del mismo modo, las células S2 pueden ser co transfected con muesca y Delta o serrado ligandos (por ejemplo, cis-ligandos). CIS-ligandos en estas células expresando muesca S2 derogar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y resultado en disminución de agregado formación8,12,14. La disminución relativa de formación agregada causada por cis-ligandos proporciona una medida del efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-ligandos (figura 2). Por consiguiente, se utilizaron estudios de agregación de células para examinar el efecto de la pérdida de xylosylation de trans– y cis-interacciones entre la muesca y sus ligandos.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudios de agregación de células para evaluar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y su inhibición por cis-ligandos utilizando células S2 de Drosophila . Por ejemplo, ofrecemos los datos que nos permitieron determinar el efecto de la muesca xylosylation de enlace entre la muesca y trans-Delta8. Estos ensayos sencillos proporcionan una evaluación semi-cuantitativa de las interacciones ligando-muesca en vitro y determinar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de los modificadores de la vía de Notch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canónica de la señalización de Notch depende de las interacciones entre el receptor Notch y sus ligandos5. Aunque la mayoría de los estudios sobre la vía de Notch considera principalmente la Unión de ranura y ligandos de células vecinas (trans), muesca y misma célula ligandos interactúan y estos llamados cis-interacciones pueden desempeñar un papel inhibitorio en la muesca señalización de3,4. Por consiguiente,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen apoyo de NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) y Fundación Mizutani Glycoscience (grant #110071 a HJN) y están agradecido a Tom V. Lee por discusiones y sugerencias sobre los ensayos y Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine y el Drosophila genómica recursos centro (DGRC) para líneas celulares y plásmidos.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
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