Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Ashutosh Pandey; Hamed Jafar-Nejad

doi:10.3791/56919

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Article de méthode

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

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DOI :

10.3791/56919

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2 janvier 2018

Ashutosh Pandey¹ , Hamed Jafar-Nejad¹^,²

¹Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, ²Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Complexité des systèmes de in vivo , il est difficile de distinguer entre l’activation et inhibition du récepteur Notch par trans- et cis-ligands, respectivement. Nous présentons ici un protocole basé sur in vitro tests cellulaires-agrégation pour évaluation qualitative et semi quantitative de la liaison de l’encoche de la drosophile à trans-ligands vs cis-ligands.

Résumé

La signalisation Notch est un système de communication de cellules évolutivement conservés utilisé largement en développement animal et entretien adulte. Interaction des récepteurs Notch avec des ligands de cellules voisines induit l’activation de la voie de signalisation (trans-activation), tandis que l’interaction avec les ligands de la même cellule inhibe la signalisation (cis-inhibition). Juste équilibre entre trans-activation et cis-inhibition permet d’établir des niveaux optimaux de la signalisation Notch dans certains contextes au cours du développement animal. En raison des domaines d’expression qui se chevauchent de Notch et ses ligands dans plusieurs types de cellules et de l’existence de mécanismes de rétroaction, étudier les effets d’une modification post-traductionnelle donnée sur trans- et cis-interaction de la protéine Notch et ses ligands in vivo est difficile. Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation de cellules S2 Drosophila lors d’essais de la cellule-agrégation d’évaluer les effets de faire tomber un modificateur de parcours de Notch sur la liaison de la protéine Notch à chaque ligand dans trans et cis. Cellules S2 stablement ou transitoirement transfectées avec un vecteur exprimant l’encoche sont mélangés avec les cellules exprimant chaque ligand de Notch (S2-Delta ou S2-Serrate). TRANS-liaison entre les récepteurs et ligands se traduit par la formation d’agrégats cellulaires hétérotypiques et est mesurée en termes de nombre d’agrégats par mL composé de > 6 cellules. D’examiner l’effet inhibiteur du cis-ligands, S2 cellules exprimant conjointement Notch et chaque ligand sont mélangées avec des cellules S2-Delta ou S2-Serrate et le nombre d’agrégats est quantifié comme décrit ci-dessus. La diminution relative du nombre d’agrégats en raison de la présence de cis-ligands fournit une mesure de cis-ligand-médiée par l’inhibition de la trans-liaison. Ces tests simples peuvent fournir des données semi-quantitatives sur les effets des manipulations génétiques ou pharmacologiques sur la liaison de la protéine Notch à ses ligands et peuvent aider à déchiffrer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des ces manipulations sur la signalisation Notch.

Introduction

La signalisation Notch canonique est un mécanisme de communication de cellule à cellule à courte portée qui nécessite un contact physique des cellules pour faciliter l’interaction entre les récepteurs Notch et leurs ligands¹voisines. Interaction des récepteurs Notch (présent sur la surface des cellules de récepteur de signal) avec des ligands (présentes à la surface de l’envoi de signal cellules) initie la signalisation Notch et est connu comme trans-activation². En revanche, l’interaction entre l’encoche et ses ligands dans la même cellule entraîne l’inhibition de la voie Notch et est connue comme cis-....