Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up
Summary
Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.
Abstract
Acute myeloïde leukemie (AML) is een heterogene, en indien niet behandeld, dodelijke ziekte. Het is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit bij volwassenen. In eerste instantie is AML een ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van leukemie blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van cellen van de stam van de leukemie (LSC), met deze dynamische cel compartiment evolueren om te overwinnen van verschillende selectie druk opgelegd tijdens leukemie progressie en behandeling. Als u wilt verder definiëren de LSC-bevolking, kunt de toevoeging van CD90 en CD45RA de discriminatie van normale HSCs en multipotente voorlopercellen binnen het CD34 + CD38-cel compartiment. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige expressie van verschillende vermeende LSC markers (CD34 CD38, CD45RA, CD90) op primaire blast cellen van menselijke AML door multiparametric stroom cytometry. Bovendien tonen we hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts. Deze methode voor de detectie en kwantificering van vermeende LSC mogen worden gebruikt voor klinische follow-up van chemotherapie reactie (dwz., minimale residuele ziekte), zoals residuele LSC AML terugval kan veroorzaken.
Introduction
Acute myeloïde leukemie (AML) is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit. AML is in eerste instantie een klonale ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Onlangs, klonen heterogeniteit van de blast-celpopulatie is opgezet in wezen met behulp van de volgende generatie sequencing (NGS) strategieën en toont het bestaan van intra klonale evolutie van tumor cellen1.
Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van leukemische cellen van de stam (LSC). Het is dat deze dynamische cel compartiment evolueert om te overwinnen van verschillende selectie druk tijdens leukemie progressie en behandeling opgelegd hypothetische. Daarom LSC moeten bestand zijn tegen de huidige chemotherapeutische regimes en bemiddelen van relapse van de ziekte, met ernstige klinische gevolgen2. Diverse markeringen zijn beschreven LSC karakteriseren zoals CD1233, CLL-14, CD975 of TIM-3-6. De CD34 + CD38-vaks blast cellen wordt geacht te worden verrijkt voor GSC7 maar ook normale HSC. CD90 en CD45RA uitdrukking toegepast op de CD34 + CD38-(P6) compartiment (Figuur 1) vliegvergunningen scheiden van de verschillende stadia van normale en kwaadaardige hematopoietische precursoren8. Specifiek, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotente voorlopercellen (MPP) zoals CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-cellen en CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymfoïde-primer multipotente voorlopercellen (LMPP) kunnen worden bepaald in de meeste AML gevallen van8 ,9. De intensiteit (MFI’s) van de gemiddelde fluorescentie van CD38 is bijzonder belangrijk beschouwd binnen het CD34 + cel compartiment. Omdat CD38 intensiteit drie nieuwe cel compartimenten daarvan definieert: CD38 negatief (P6), CD38 dim (P7) en heldere CD38 (P8) (Figuur 1). De MFI van CD38 kan worden bepaald met behulp van hematogones en/of plasmacellen als een interne positieve controle als deze cellen sterk express CD38.
De immunodeficiëntie muismodel van knik/SCID/IL2Rγcnull (NSG) wordt veel gebruikt voor engraftment van normaal en kwaadaardige mens hematopoietische cellen10,11. Seriële xenotransplantatie testen worden gebruikt om experimenteel valideren LSC of HSC functie. Deze studies hebben uitgebreid geanalyseerd door grootschalige sequencing benaderingen. Niettemin, is minder bekend over de LSC en HSC immunophenotype van AML blast bevolking geaccepteerd in NSG muizen ten opzichte van haar primaire AML (Figuur 2).
De nummers van de LSC zijn inherent lage dus, identificatie en kwantificering van LSC zijn uitdagend en de hier beschreven methode kan worden gebruikt als een flow cytometrische bepaling bij diagnose en klinische volgen tot evalueren chemotherapie reactie (zoals residuele LSC kan AML terugval veroorzaken). De aanwezigheid van LSC kan duiden op positieve minimale residuele ziekte (MRD). Tot op heden, MRD toezicht op AML meestal vertrouwen op moleculaire methoden (d.w.z., RT-PCR, NGS)10,12. Nochtans, in dit protocol ontdekken we gelijktijdige eiwit expressie van verschillende HSC/LSC markers (CD34 CD38, CD45RA, CD90) op primaire blast cellen van menselijke AML door multiparametric stroom cytometry2,8,9. Deze combinatie van antilichamen kan worden toegepast in een standaard stroom cytometry laboratorium en deze stroom MRD test is vooral interessant wanneer MRD door real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) niet mogelijk is, dat wil zeggen, als leukemie specifieke moleculaire Markeringen zijn niet aantoonbaar in het diagnostische AML monster. Bovendien, dit protocol, is een aanvulling op de meer gevoelige technieken voor moleculaire MRD, zoals het is bedoeld voor het detecteren en kwantificeren van de abnormale hematopoïetische voorlopercellen die vertegenwoordigt een functionele cel kenmerk (Figuur 3).
We laten zien hoe te kwantificeren van drie hematopoïetische voorlopercellen populaties en de vermeende LSC compartiment met verschillende mate van rijping door stroom cytometry met antilichamen beschikbaar in de meeste klinische laboratoria. Bovendien, we bevestigd van de aanwezigheid van deze cel compartimenten in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts (PDX) en bij de behandeling opvolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een nauwkeurige en reproduceerbare evaluatie van membraan of cytoplasmatische markeringen door stroom cytometry vereist dat de instrumentele instellingen elke dag voor optische uitlijning, goede werking van de fluidic systeem, optische gevoeligheid en normalisatie worden geverifieerd met behulp van kalibratie kralen.
Detectie van blast cel populaties in AML met behulp van CD90 en CD45RA door multi parametrische stroom cytometry analyse is een relatief eenvoudige en betrouwbare methode. Een cru…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Franse Vereniging Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Noord-Midden), Fondation de France (leukemie Committee), SIRIC Oncolille en Frans National Cancer Institute.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
