Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up
Summary
Descriviamo un protocollo per rilevare l’espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.
Abstract
Leucemia mieloide acuta (AML) è un eterogeneo e se non trattata, la malattia mortale. È la causa più comune di mortalità per leucemia-collegato in adulti. Inizialmente, AML è una malattia delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio di leucemia e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemia (LSC), con questa dinamica cella vano in evoluzione per superare varie pressioni di selezione imposto durante il trattamento e la progressione della leucemia. Per definire ulteriormente la popolazione di LSC, l’aggiunta di CD90 e CD45RA permette la discriminazione di HSCs normali e di progenitori multipotenti all’interno dello scompartimento CD34 + CD38-cella. Qui, descriviamo un protocollo per rilevare l’espressione simultanea di diversi markers putativi di LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umano mediante citometria a flusso multiparametrica. Inoltre, mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti. Questo metodo di rilevazione e quantificazione di putativi LSC può essere utilizzati per il follow-up clinico della risposta di chemioterapia (cioè., malattia residua minima), come residuo LSC può causare la ricaduta AML.
Introduction
Leucemia mieloide acuta (AML) è la più comune causa di mortalità per leucemia-collegato. Inizialmente, AML è una malattia clonale di cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Recentemente, clonale eterogeneità della popolazione cellulare blast è stata stabilita essenzialmente utilizzando strategie di sequenziamento (NGS) prossime generazione e mostrando l’esistenza di sviluppo intra-clonale di cellule di tumore1.
Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemiche (LSC). È supposto che questo comparto dinamico delle cellule si evolve per superare varie pressioni di selezione imposte durante il trattamento e la progressione della leucemia. LSC dovrebbero pertanto essere resistente ai regimi chemioterapeutici correnti e mediare la ricaduta di malattia, con profonde implicazioni clinico2. Vari indicatori sono state descritte per caratterizzare LSC come CD1233, CLL-14, CD975 o6di TIM-3. Il CD34 + CD38-vano delle cellule di scoppio è considerato essere arricchita per LSC7 ma include anche normale HSC. CD90 e CD45RA espressione applicata per il CD34 + CD38-vano (P6) (Figura 1) consente di separare le diverse fasi di precursori emopoietici normali e maligne8. In particolare, CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotenti progenitori normali (MPP) come CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-cellule e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellule progenitrici multipotenti linfoide-innescato (LMPP) possono essere determinate nella maggior parte di AML casi8 ,9. L’intensità media di fluorescenza (MFI) di CD38 è particolarmente importante da considerare all’interno del compartimento delle cellule CD34 +. Perché CD38 intensità definisce tre compartimenti cellulari nuovi della stessa: CD38 negativo (P6), CD38 dim (P7) e CD38 brillante (P8) (Figura 1). Il MFI di CD38 può essere determinato utilizzando hematogones e/o cellule di plasma come controllo positivo interno come queste cellule esprimono fortemente CD38.
Il modello immunodeficiente del topo NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) è ampiamente usato per engraftment delle normali e maligne umane ematopoietiche cellule10,11. Lo xenotrapianto seriale dosaggi sono utilizzati per convalidare sperimentalmente funzione LSC o HSC. Questi studi sono stati ampiamente analizzati da approcci di sequenziamento su larga scala. Tuttavia, meno è conosciuto circa il immunophenotype LSC e HSC della popolazione di scoppio AML engrafted nei topi NSG rispetto al suo primario AML (Figura 2).
I numeri di LSC sono intrinsecamente bassi così, identificazione e quantificazione di LSC sono impegnativi e il metodo qui descritto può essere utilizzato come un test citofluorimetrico alla diagnosi e alla clinica seguire per valutare la risposta di chemioterapia (come residuo LSC può causare una ricaduta AML). La presenza di LSC può indicare positiva malattia minima residua (MRD). Ad oggi, MRD monitoraggio in AML per lo più si basano su metodi molecolari (cioè, RT-PCR, NGS)10,12. Tuttavia, in questo protocollo rileviamo l’espressione della proteina simultanea di diversi marcatori HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umana da multiparametrico flusso cytometry2,8,9. Questa combinazione di anticorpi può essere applicata in qualsiasi laboratorio di citometria a flusso standard e questo saggio MRD di flusso è particolarmente interessante quando MRD da reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) non è possibile, cioè, se specifico di leucemia molecolare gli indicatori non sono rilevabili nel campione diagnostico AML. Inoltre, questo protocollo, è complementare alle tecniche MRD molecolari più sensibili, come esso mira a individuare e quantificare le cellule progenitrici ematopoietiche anomale che rappresenta una caratteristica funzionale delle cellule (Figura 3).
Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici ematopoietiche e il vano di LSC putativo con diverso grado di maturazione da citometria a flusso con anticorpi disponibili nella maggior parte dei laboratori clinici. Inoltre, abbiamo confermato la presenza di questi compartimenti cellulari nel corrispondenti paziente-derivato-xenotrapianti (PDX) e al trattamento di follow-up.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una valutazione accurata e riproducibile di membrana o marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso è necessario che le impostazioni dello strumento vengono verificate ogni giorno per allineamento ottico, corretto funzionamento del sistema fluidico, sensibilità ottica e standardizzazione usando le perle di calibrazione.
Rilevazione di popolazioni di cellule di scoppio in AML con CD90 e CD45RA attraverso l’analisi di citometria a flusso multiparametrica è un metodo relativamente sem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte il francese Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (centro nord), Fondation de France (Comitato di leucemia), Oncolille SIRIC e francese National Cancer Institute.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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