Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير، تم تجسيدها في قلوب الماوس عبر الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، غدية تم حقن جينات محددة الترميز مع حقنه في عضلة القلب، تليها قياس التعبير البروتين عن طريق التصوير في فيفو والغربية لطخة تحليل.
Abstract
إلى حد كبير تحفيز التلاعب بالجينات على وجه التحديد في القلب التحقيق باثوميتشانيسمس أمراض القلب وإمكاناتها العلاجية. ويتحقق في فيفو إيصال الجينات الخاصة بالقلب عادة بالتسليم أما منهجية أو المحلية. حقن الجهازية عن طريق الوريد الذيل سهل وفعال في معالجة التعبير الجيني القلب باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف 9 (AAV9). بيد أن هذا الأسلوب يتطلب كمية عالية نسبيا من ناقلات لكفاءة توصيل، وقد ينتج عن توصيل الجهاز nontarget الجينات. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة، وتوفير الوقت لحقن إينتراميوكارديال في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير (بدون تهوية)، تم تشريح العضلات الرئيسية والثانوية صدري صراحة، وتعرضت قلب الماوس بسرعة بتخريج اليدوي من خلال شق صغير في الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، تم حقن إتش ترميز لوسيفراس (لوك) ومستقبلات فيتامين (د) (لزاما)، أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا) استهداف لزاما، مع حقنه هاملتون في عضلة القلب. اللاحقة في فيفو تصوير أثبتت أن لوسيفراس كان أوفيريكسبريسيد بنجاح على وجه التحديد في القلب. وعلاوة على ذلك، أكد تحليل لطخة غربية overexpression ناجحة أو إسكات لزاما في قلب الماوس. متى يتقن، يمكن استخدام هذا الأسلوب للتلاعب بالجينات، فضلا عن حقن الخلايا أو مواد أخرى مثل نانوجيلس في قلب الماوس.
Introduction
أمراض القلب هي السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم1،2. عدم وجود استراتيجيات علاجية فعالة لأمراض القلب تهدد الحياة بما في ذلك احتشاء عضلة القلب وفشل القلب يجذب استكشاف مكثفة من باثوميتشانيسمس الأساسية، وتحديد الخيارات العلاجية رواية3. لهذه الاستكشافات العلمية، هو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب المستخدمة على نطاق واسع4،5. التلاعب بالجينات القلب يمكن أن يتحقق عن طريق تحرير الجينوم باستخدام نوكلاس المستجيب مثل المنشط النسخ قوية (TALEN) وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)/كريسبر المرتبطة البروتين 9 (Cas9) الأدوات، أو عن طريق تسليم المواد الوراثية خارج الرحم (مثلاً، نواقل فيروس يحمل جينات ترميز البروتينات للفائدة)6. على الرغم من تحرير الجينوم تسمح التعديلات الجينوم الدقيقة والزمانية المكانية في الفئران الحية، إلا أنها لا تزال الناحية العملية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة6. وبدلاً من ذلك، إجراء معالجة الجينات الخاصة بالقلب بناقل الفيروس أو التدخل الصغيرة تسليم مجمع الجيش الملكي النيبالي (siRNA) يتم بصورة روتينية6.
ويتحقق تسليم ناقل الفيروس إلى قلب الماوس الكبار باستراتيجيتين تقريبا: حقن النظمية أو المحلية. حقن النظمية للنمط المصلي المسيطر كارديوتروبيك من آفس مثل AAV9 موسع ل التلاعب بالجينات محددة القلب7. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب كمية عالية نسبيا من ناقلات اللازمة لتوصيل تتسم بالكفاءة، والتعبير الجيني، وقد يؤدي مهمة توصيل أجهزة nontarget مثل العضلات و الكبد7. حقن الفيروسات المحلي يتحقق عن طريق الحقن إينتراميوكارديال أو الولادة إينتراكوروناري7. تسليم إينتراكوروناري يؤدي إلى توزيع أكثر توازناً للفيروس داخل القلب مقارنة بحقن إينتراميوكارديال. عيوب هذا الأسلوب غير الغسيل السريع خارجاً من النواقل الفيروسية إلى الدوران الجهازي وتوصيل في أجهزة nontarget8, ومتطلباتها من الأجهزة لقياس الضغط أثناء العملية. في المقابل، تمكن حقن إينتراميوكارديال أفضل الاحتفاظ بالفيروس في عضلة القلب فضلا عن تسليم موقع معين، ولكن فشل لتوزيعها بالتساوي الفيروسية ناقلات7. للحيوانات الصغيرة، يتم تسليم إينتراكوروناري صعبة من الناحية الفنية لإجراء، بينما الجهازية AAV9 حقن وحقن إينتراميوكارديال هي أكثر شيوعاً تمارس4،،من57. على الرغم من أن حقن النظامية من السهل القيام، يتطلب التهوية الميكانيكية و thoracotomy حقن إينتراميوكارديال التقليدية يسبب تلف الأنسجة واسعة النطاق، وتستغرق وقتاً طويلاً.
وفي هذا التقرير، وصفت لنا طريقة سهلة، وتوفير الوقت، وذات كفاءة عالية لحقن إينتراميوكارديال. تم حقن إتش ترميز لوسيفراس ولزاما، أو شرنا استهداف لزاما، للتلاعب بالجينات القلب. متى يتقن، يمكن استخدام هذا الأسلوب للتلاعب بالجينات، فضلا عن حقن الخلايا أو غيرها من المواد في قلب الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات نفذت وفقا للمبادئ "التوجيهية الوطنية للمعاهد الصحية" على "استخدام الحيوانات المختبرية"، وقد وافقت "لجنة الأخلاقيات الحيوان" للمعهد. واستخدمت لجميع التجارب الفئران الذكور C57BL/6J (الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع). تم إيواء الفئران تحت ظروف خالية من العوامل الممرضة في 24 درجة مئوية ± 4 درجة مئوية، وتحت 12-ح دورة الضوء/الظلام، مع حرية الوصول إلى المياه والغذاء.
1-إعداد حل إتش
- عند الوصول للحل إتش المنقي، تخزين الحل في ثلاجة-80 درجة مئوية.
ملاحظة: أجريت حقن إتش في الفئران قادرة على البقاء. أن تكفل العقم ناقل إتش إتش (لوسيفراس الترميز أو لزاما شرنا استهداف لزاما) أعدت وتنقية تجارياً9،10. - في يوم العملية، إخراج الحل إتش المنقي (3 × 1010 البلاك تشكيل وحدات [بفو]/mL) من الثلاجة-80 درجة مئوية، وذوبان الجليد إتش ناقلات الحل على الجليد.
- وضع على فاسيماسك وقفازات معقمة والعقيمة بثوب.
- إعداد 50-ميليلتر حقنه هاملتون الذي قد تم تعقيمها قبل العملية اليوم.
ملاحظة: كان للتعقيم، والمحاقن هاملتون ملفوفة في شاش ووضعها في معقم ضغط ارتفاع درجة حرارة/عالية. تم اختيار طريقة "التعقيم الصلبة" وبدأ بالتعقيم بالضغط على زر "ابدأ". - بعد ذوبان الجليد كاملة من الحل إتش المنقي، رش الأنبوبة التي تحتوي على الحل إتش مع الإيثانول 75%، ونقل الحل إتش إلى غطاء معقم الاندفاق الصفحي.
- في غطاء معقم الاندفاق الصفحي، نضح 50 ميليلتر إتش الحل باستخدام المحاقن هاملتون دون إبرة، تليها مرفق إبرة ز 30 للمحاقن هاملتون.
- عقد المحاقن مع 30 جرام الإبرة إلى الأعلى، ودفع المكبس للمحاقن بلطف حتى يتم شغل الإبرة مع الحل إتش (مؤكدة بظهور قطرات الحل الأول من طرف الإبرة).
ملاحظة: يستغرق حوالي 45 ميليلتر حل لشغل الإبرة 30 غرام، حتى الآن تقريبا لا يوجد حل غير مرئية في المحاقن. - استخدام المحاقن استعداد أعلاه لنضح آخر 30 ميليلتر إتش الحل بعناية، ووضع المحاقن توج فضفاضة على الجليد للاستخدام اللاحق.
2-التخدير وإعداد المنطوق
- إضافة 20 مل إيسوفلوراني إلى المبخر isoflurane، والاتصال المرذاذ isoflurane دبابة الأوكسجين.
- فتح الصمام والأكسجين واسمحوا تدفق من خزان الأوكسجين إلى المبخر إيسوفلوراني. الحفاظ على معدل تدفق الأكسجين في 2 لتر في الدقيقة عن طريق جهاز تدفق أكسجين في المبخر إيسوفلوراني.
- حمل التخدير الماوس مع إيسوفلوراني 4 ٪ في الأكسجين 100% (2 لتر في الدقيقة) لمدة 2 دقيقة في قفص بلاستيكية متصلة المبخر إيسوفلوراني.
- تأخذ بها الماوس أنيسثيتيزيد من القفص البلاستيك، وتأمينه على منصة بلاستيكية في موقف المعرضة في غطاء معقم الاندفاق الصفحي والمحافظة على التخدير مع إيسوفلوراني 2% في الأكسجين 100% (2 لتر في الدقيقة) عن طريق مخروط الآنف.
- تأكيد التخدير الكافي بسبب عدم استجابة قرصه أخمص القدمين.
- تطبيق كريم العيون العقيمة لكل عين لحماية القرنيات من التجفيف.
- يحلق في الصدر والجزء العلوي من البطن. تطبيق كريم مزيل الشعر المتاحة تجارياً إلى موقع حلق لإزالة الحد الأدنى 1 كريم مزيل الشعر وتبقى الفراء مع جاوزيس الرطب.
- تعقيم موقع الجراحية (الجزء السفلي الأيسر من الصدر) مع دعك 3 من اليود-الكلورهيكسيدين أساس مطهر (مثل انتويوديني). تغطية الموقع الجراحي مع ثني عقيمة.
3-إينتراميوكارديال حقن إتش في قلب الماوس
- خلع القفازات ووضع على زوج جديد من القفازات المعقمة.
- تعقيم الملقط، هيموستات الصغرى-البعوض، وزوج من مقص الجراحة، وحامل إبرة في اليوم السابق للعملية في ارتفاع درجة الحرارة/عالية الضغط المطهر (انظر الملاحظة الخطوة 1، 4).
- جعل شق جلد 0.5 سم على طول الخط الذي يربط بين الرهابه والإبطين. صراحة تشريح الصدرية الرئيسية والعضلات طفيفة صدري بالملقط وهيموستات الصغرى-البعوض.
- كشف المساحات ربية بتراجعه الصدرية الرئيسية والعضلات طفيفة صدري. بيرس من خلال وفتح الفضاء ربية الرابعة (أو الفضاء ربية أوسع بالمراقبة) مع هيموستات الصغرى-البعوض.
- دفع القلب اتجاه الشق تخريج القلب بسبابة اليد غير المهيمنة بالضغط بلطف على الجانب الأيمن من جدار الصدر.
- تأمين بلطف قلب الخارجية مع السبابة والإبهام من اليد غير المهيمنة.
- ضخ ما مجموعة 30 ميليلتر إتش الحل في عضلة القلب البطين الأيسر في ثلاثة مواقع (الجدار البطني والظهريه والجانبي من البطين الأيسر) عن طريق حقنه هاملتون مليئة إتش (الشكل 1) مع اليد المسيطرة.
- بعد انتهاء حقن، فورا مكان القلب العودة إلى الحيز الوعائي.
- إخلاء الهواء في الحيز الوعائي يدوياً عن طريق الضغط بلطف على جدار الصدر تجاه موقع شق الجلد.
ملاحظة: يمكن أن يدل الإجلاء الجوي الناجحة التي ترفرف الصدرية الكبرى وصدري العضلات الثانوية الناجمة عن الهواء المطرود. - إغلاق الجلد بخياطة مفرش الأفقي مع خياطة حرير 5-0.
ملاحظة: الصدرية الكبرى وصدري عضلات بسيطة ينبغي أن لا تكون خياطة، نظراً لأنها هي فقط صراحة تشريح وهياكلها تشريحية سليمة طوال العملية.
4-بعد عملية إدارة
- إدارة البوبرينورفين (3 مغ/كغ) مرتين يوميا عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم بعد العمليات الجراحية عن 48 ساعة الأولى بعد العملية11.
- بعد العملية مباشرة الحفاظ على الفئران على لوحة حرارة (37 درجة مئوية) حتى شُفي تماما. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص بعد أن يتعافى تماما.
- تعقيم تستخدم هاملتون حقنه وابرة حقنه ز 30 في معقم ضغط ارتفاع درجة حرارة/عالية (انظر الملاحظة الخطوة 1، 4). جمع ز 30 حقنه إبرة معقمة في حاوية الأدوات الحادة.
5. في فيفو تصوير لقياس التعبير لوسيفراس القلب
- في يوم 5 بعد حقن إتش، تعد حلاً أسهم جديدة من لوسيفرين في 15 ملغ/مل في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). تصفية الحل عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
- داخل بيريتونيلي حقن الفئران مستيقظا مع الحل لوسيفرين في 150 مغ/كغ من وزن الجسم.
- قم بتشغيل نظام التصوير.
- بعد الاختبار الذاتي لنظام التصوير التلقائي، حدد وضع التصوير ك "الإنارة"، وجعل الإعدادات التالية: التعرض: السيارات؛ Binning: 8؛ FStop: 1؛ الإثارة: الكتلة؛ الانبعاثات: مفتوحة.
- في 10 دقيقة بعد حقن لوسيفرين، تخدير الفئران بحقن كلورال هيدرات (300 ملغ/كغ من وزن الجسم). تأكيد التخدير الكافي بسبب عدم استجابة قرصه أخمص القدمين.
- تأمين الفئران أنيسثيتيزيد في مرحلة تصوير ساخنة في الموقف الذي عرضه، مع الصدر موجهة نحو الكاميرا.
- جمع الصور (صورة 1 لكل الماوس) وقياس كثافة الإشارات عن طريق رسم المناطق قياس دائرية متطابقة للفائدة (ROI) حول الصدر.
- بعد مجموعة الصور والتضحية الفئران وجمع الأنسجة كما هو مذكور في المقطع التالي.
6-حصاد الأنسجة
- في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن الفيروس (الشكل 1B)، تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 4 ٪، والحفاظ على التخدير مع إيسوفلوراني 2% عن طريق مخروط الآنف، وتأمينه على منصة بلاستيكية في موقف المعرضة.
- تجعل من شق البطني خط الوسط في الرقبة الأمامية. كشف الشريان السباتي المشترك الحق بسحب العضلات أوموهيويد والترقويه.
- التضحية الفئران ترانسيكتينج الشريان السباتي المشترك الحق وتذكية.
- تجعل من شق البطني خط الوسط في البطن. قطع الأضلاع من كلا الجانبين من القفص الصدري على طول الخط الكتفي، وقطاع الحجاب الحاجز.
- كشف القلب عن طريق رفع في الرهابه. العثور على الشريان الاورطي تصاعدي وإزالة الأنسجة الدهنية ارتشاح بلطف.
- كانولاتي الشريان الاورطي ونتخلل القلب ريتروجراديلي بإبرة ز 30 يعلق على 1 مل حقنه مليئة 0.5 مل من 4 درجات مئوية الفوسفات المخزن المؤقت الحل (PBS).
- بعد نضح، المكوس في القلب، وتقسم إلى البطينين الأيسر والأيمن. المكوس في الكبد والرئة والطحال.
- بعد يغسل اثنين في برنامج تلفزيوني الباردة (4 درجة مئوية)، تخزين كل الأنسجة التي تم جمعها بشكل منفصل في قنينات المبردة في نيتروجين سائل.
7-تحديد التعبير البروتين
- يعد التجانس المخزن المؤقت عن طريق إضافة كوكتيل مثبط البروتياز في المخزن المؤقت لتحلل متوفرة تجارياً بنسبة 1: 100. حساب الحجم الإجمالي استناداً إلى عدد العينات بحيث تتم معالجتها. الحفاظ على التجانس إعداد المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية للاستخدام اللاحق.
- إخراج الأنسجة من خزان النتروجين السائل. وزن الأنسجة على مقاييس عالية الدقة (حوالي 60 ملغ لكل قطعة من الأنسجة).
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة. فور إضافة 200 ميليلتر التجانس المخزن المؤقت وكرات الصلب بريكوليد 1.5 ملم (4 درجة مئوية) في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- تأمين أنابيب ميكروسينتريفوجي في بريكوليد (4 درجات مئوية) أصحاب المعادن في أنسجة تلقائي آلة طحن، وتبدأ التجانس قبل بدء تشغيل الجهاز بالإعدادات التالية: التردد: هرتز 70؛ الوقت: 120 ثانية.
- بعد التجانس، الطرد المركزي هوموجيناتي (16,000 ز ×، 4 درجة مئوية)، ونقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة مع ماصة 100 ميليلتر.
- أضف تحميل المخزن المؤقت الحل (5 س) للبروتين طافية بنسبة 1:4، وتجريدها من البروتين في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- مستويات البروتين التعبير في القلب والأنسجة الجهاز الأخرى تخضع لمواصلة تحليل لطخة غربية (الممثل وترد النتائج في الشكل 2 و الشكل 3) وفقا للبروتوكول تم وصفه سابقا12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول التجربة وبعض الخطوات الرئيسية لأسلوب الإبلاغ عنها يرد في الشكل 1. في 5 أيام بعد الحقن إينتراميوكارديال من إتش لوسيفراس الترميز (ادف لوك)، في فيفو التصوير في لوك ادف حقن الفئران أوضحت قوية overexpression من لوسيفراس على وجه التحديد في القلب (الشكل 2 أ، ب)، الذي كان وأكد تحليل لطخة غربية (الشكل 2)، مما يوحي بعدم وجود توصيل الجهاز nontarget. وفي المقابل، تم الكشف عن أي تعبير لوسيفراس في مكافحة الفئران. تمشيا مع overexpression ناجحة من لوسيفراس، غرب لطخة التحليل المقترح التعبير لزاما زيادة ملحوظة في البطين الأيسر من الفئران حقن إتش ترميز لزاما (ادف لزاما) (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، حقن صفدر ادف انخفاضا كبيرا التعبير لزاما في البطين الأيسر (الشكل 3B). على النقيض من ذلك، التعبير لزاما لم يتم إلى حد كبير تغيير في البطينين الحق لا في ادف-لزاما حقن الفئران أو ادف-صفدر حقن الفئران (الشكل 3 د)، نظراً إتش كان فقط حقن في عضلة القلب البطين الأيسر.
الشكل 1 . مخطط للماوس إينتراميوكارديال الحقن والجينات التعبير بروتوكول اكتشاف- (أ) رسم توضيحي يبين ثلاثة مواقع للحقن في عضلة القلب البطين الأيسر. (ب) بروتوكول للكشف عن التعبير الجيني في قلب الماوس بعد حقن فيروسات المشار إليه. ادف-لوسيفراس: إتش ترميز لوسيفراس؛ أدفدر: إتش ترميز لزاما؛ أدشفدر، شرنا ترميز إتش استهداف لزاما. (ج) صور الممثل تظهر العديد من الخطوات لتعديل أسلوب الحقن إينتراميوكارديال الماوس. أ إزالة الفراء بكريم مزيل الشعر المتاحة تجارياً. ب تعقيم موقع الجراحية مع دعك 3 من بوفيدون. جيم تغطي الموقع الجراحي مع ثني عقيمة. د شق الجلد 0.5 سم على طول الخط الذي يربط بين الرهابه والإبطين. هاء بلانت التشريح الصدرية الرئيسية والعضلات طفيفة صدري بالملقط وهيموستات الصغرى-البعوض. تخريج واو من القلب. زاي ضخ 30 ميليلتر إتش الحل في عضلة القلب البطين الأيسر عن طريق المحاقن هاملتون. ح - أولاً إغلاق الجلد بسلسلة مال خياطة مع خياطة حرير 5-0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الكشف عن التعبير لوسيفراس في القلب- (أ) الصور التي تم جمعها من نظام التصوير تظهر إشارة الإنارة القلب في مكافحة الفئران والفئران حقن إتش 5 أيام بعد الحقن لترميز لوسيفراس. (ب) كثافة إشارة الإنارة في مجموعات مختلفة (n = 3) تخضع للتحليل الإحصائي باختبار t . ف < 0.01 مقابل مكافحة الفئران. (ج) تحليل لطخة غربية النتائج تبين لوسيفراس مستويات البروتين في القلب، الرئتين والكبد والطحال في ذكر المجموعات في 5 أيام بعد حقن إتش (n = 3). حيث تم الكشف عن التعبير لوسيفراس فقط في قلب مدينة ادف-لوك حقن الفئران، لم يتم إجراء التحليل الإحصائي. ادف-لوك: إتش ترميز لوسيفراس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . الكشف عن التعبير لزاما في القلب- (أ) أعلى اللوحة: لطخة غربية العصابات تظهر مستويات لزاما في البطين الأيسر (حيث يتم حقن إتش) في اليوم 0، 5 أيام، 7 أيام، و 14 يوما بعد حقن ادف لزاما. لوحة أسفل: تحليل شبه كمي لمستويات التعبير لزاما في مجموعات مختلفة (n = 4 كل نقطة مرة). تطبيع ضد جابده النتائج وتحويلها إلى إضعاف نسبة التغيير إلى 0 يوم. وأجرى اتجاه تحليل التباين (ANOVA) متبوعاً بالاختبار بعد انتهاء بونفيروني (تساوي الفروق المفترضة) أو تامان بعد انتهاء الاختبار (تباينات متساوية لا يفترض) للتحليل الإحصائي. ف < 0.05 أو * *ف < 0.01 مقابل 0 يوم. (ب) أعلى اللوحة: لطخة غربية العصابات تظهر مستويات لزاما في البطين الأيسر في اليوم 0، 3 أيام، 5 أيام، و 7 أيام بعد الحقن ادف صفدر. لوحة أسفل: تحليل شبه كمي لمستويات التعبير لزاما في مجموعات مختلفة (n = 4 كل نقطة مرة). ف < 0.05 مقابل 0 يوم. (ج) أعلى اللوحة: لطخة غربية العصابات تظهر مستويات لزاما في البطين الأيمن (حيث لا تحقن في إتش) في اليوم 0، 5 أيام، 7 أيام، و 14 يوما بعد حقن ادف لزاما. لوحة أسفل: تحليل شبه كمي لمستويات التعبير لزاما في مجموعات مختلفة (n = 4 كل نقطة مرة). (د) أعلى اللوحة: لطخة غربية العصابات تظهر مستويات لزاما في البطين الأيمن في اليوم 0، 3 أيام، 5 أيام، و 7 أيام بعد الحقن ادف صفدر. لوحة أسفل: تحليل شبه كمي لمستويات التعبير لزاما في مجموعات مختلفة (n = 4 كل نقطة مرة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا التقرير يوضح تقنية معدلة لحقن إينتراميوكارديال من النواقل الفيروسية للتلاعب بالجينات القلب، الذي عدل من أسلوب لتحريض احتشاء عضلة القلب بغاو et al. 13 حاليا، في فيفو توصيف لوظائف الجينات محددة في أغلب الأحيان تنطوي على توليد خروج المغلوب أو الفئران المعدلة وراثيا3،،من1415،16،17 ، وهي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وكثيفة العمالة. وبدلاً من ذلك، يمارس تسليم ناقلات الجينات أو siRNA بالحقن النظمية أو المحلية أيضا على نطاق واسع للتلاعب بالجينات في أبحاث القلب والأوعية الدموية4،،من57. على وجه الخصوص، لا يمكن الاستعاضة عن الحقن إينتراميوكارديال للتلاعب بالجينات القلب تحت ظروف معينة: عندما توجه موقع الحقن المطلوب (مثلاً، حقن المنطقة الحدودية في نموذج احتشاء عضلة القلب)11؛ عندما يتم التلاعب بالجينات مقيدة بالمدة المطلوبة (مثلاً، حقن إتش). هنا، نحن أظهرت أن أسلوب الحقن إينتراميوكارديال تم التعديل البسيط، وتوفير الوقت، وذات كفاءة عالية.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
للحصول على عملية ناجحة من هذا البروتوكول، ينبغي أن يلاحظ العديد من الخطوات الحاسمة. قبل الجلاء يسفط الفيروس، والهواء داخل هاملتون المحاقن والإبر المرفقة، خلاف ذلك الهواء حقنها في عضلة القلب قد تسبب الأذى القلب الموضعية أو حتى الموت. كذلك تجنب هذه المسألة، المحاقن الجاهزة للاستخدام هاملتون مليئة حجم فيروس كاف ينبغي إلا توضع مع نهاية المكبس إلى الأسفل، لأن هذا قد نضح عفويا الهواء بخطورة المكبس المعدني. ينبغي رصد التخدير بعناية، والتخدير العميق قد يؤخر الانتعاش بعد انتهاء العملية، والتخدير العميق الشديد قد يسبب الوفاة. بعد التخدير الكافي، القلب ينبغي أن لا يكون تخريجها من تجويف الصدر بالقوة، حيث قد يؤدي هذا إلى إصابة الرئة الحاد. في الواقع، تخريج القلب السليم يتطلب فقط دفعة رقيقة القلب، وأي مقاومة قد تشير إلى الدفع اتجاه غير سليم.
القيود المفروضة على هذه التقنية:
القضاء على التنبيب في هذا الأسلوب، مما يقلل من الوقت اللازم لهذا الإجراء، يقترح أنه ينبغي الانتهاء من الإجراء حقن إينتراميوكارديال ضمن إطار زمني محدود نسبيا تجنب عقوبة الإعدام. حسب تجربتنا، ينبغي عدم تخريجها القلب لأكثر من 30 ثانية، لأن هذا يزيد من معدل الوفيات ويبطئ التعافي بعد العمليات الجراحية. ولذلك، يوصي باستخدام تنبيب للمحاولات الأولى للبروتوكول هو موضح هنا. قيد آخر هو التوزيع غير المتكافئ للنواقل الفيروسية تسليمها بهذا الأسلوب، الذي يوجد أيضا في الأساليب التقليدية ل حقن إينتراميوكارديال7. وعلاوة على ذلك، الأسلوب الموصوفة هنا أكثر فائدة للتلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في قلوب يصب، التي يمكن اتباعها من قبل إنشاء مختلف أمراض القلب نماذج18،،من1920، 21،،من2223. ومع ذلك، استخدام الأسلوب الحالي في تقديم وكلاء للمصابين قلوب مثل قلوب إينفاركتيد قد تكون محدودة، لأن هذه الفئران قد لا تسمح الإجراء.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة:
حقن إينتراميوكارديال التقليدية يتطلب التنبيب والتهوية الميكانيكية24، ويجعل من الصعب تحديد موقع الحقن بسبب الماوس بسرعة نبضات القلب. هذه القضايا إلى حد كبير إطالة العملية الساعة13، وبالتالي زيادة الاختلافات الناجمة عن التأخير الزمني. تقنية تعديل المقدمة هنا سريعة ويتيح الموقع دقيقة حقن بتأمين يدوياً قلب الخارجية؛ وعموما، إلى حد كبير قد دراسة لاحقة. وعلاوة على ذلك، جعل القضاء على التنبيب والتهوية الميكانيكية طريقة المعدلة موجوداً لما يقرب من أي مختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "الصندوق الوطني للعلوم" للعلماء الشبان البارزين (81625002)، الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (81470389، 81270282، 81601238)، البرنامج من شانغهاي أكاديمية بحوث الزعيم (18XD1402400)، وبلدية شانغهاي التعليم اللجنة جوفينج الطب السريري منحة الدعم (20152209)، مركز تطوير مستشفى في شانغهاي شينكانج (16CR3034A)، جامعة شانغهاي جياو تونغ (YG2013MS42)، شانغهاي جياو تونغ جامعة مدرسة الطب (15ZH1003 و 14XJ10019)، شانغهاي الإبحار (18YF1413000)، وبرنامج الابتكار بعد التخرج من كلية الطب بنغبو (Byycx1722). ونشكر الدكتور آر قاو لمساعدته السابقة في المختبر لدينا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
