التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية
Summary
تقدم هذه الدراسة وضع بروتوكول للأنسجة يمكن عكسها المقاصة، إيمونوستينينج، 3D–تقديم وتحليل شبكات الأوعية الدموية في المشيمة البشرية الزوائد عينات تتراوح بين 1-2 مم3.
Abstract
تبادل المغذيات والغاز بين الأم والجنين يحدث في الواجهة من الدم إينتيرفيلوس الأمهات والشبكة الشعرية فيلوس الواسعة التي تشكل جزءا كبيرا من حمة المشيمة البشرية. الشبكة الشعرية فيلوس القاصي هو المحطة إمدادات الدم الجنين بعد عدة أجيال من تفريع السفن تمتد خارجاً من الحبل السري. هذه الشبكة قد غمد خلوية متجاورة، طبقة حاجز تروفوبلست المخلوي، مما يمنع اختلاط دم الجنين ودم الأم الذي هو اغتسل بشكل مستمر. الإهانات لسلامة الشبكة الشعرية المشيمة، التي تحدث في اضطرابات مثل الأمهات مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والبدانة، عواقب تلك المخاطر الصحية الخطيرة الحالية للجنين، وفيات الرضع، والكبار. لتحديد الآثار الهيكلية لهذه الإهانات بشكل أفضل، تم وضع بروتوكول لهذه الدراسة، أن يلتقط بنية الشبكة الشعرية بناء على أمر من 1-2 مم3 فيه أحد يمكن التحقيق معالمه طوبولوجي بتعقيداتها كاملة. لتحقيق هذا الهدف، يتم تشريح مجموعات من الزوائد الطرفية من المشيمة، وطبقة تروفوبلست والجهاز الشعرية إيمونولابيليد. ثم توضح هذه العينات مع أنسجة جديدة تطهير العملية التي تجعل من الممكن الحصول على رصات الصور [كنفوكل] إلى أعماق z ~ 1 مم. اﻷداءات ثلاثية الأبعاد هذه المكدسات ثم معالجتها وتحليلها لتوليد شبكة الشعرية الأساسية تدابير مثل الحجم وعدد الفروع الشعرية، ونقاط النهاية فرع الشعرية، كالتحقق من مدى ملاءمة هذا النهج وصف الشبكة الشعرية.
Introduction
فهمنا للمشيمة النامية وعن الأمراض، محدودة إلى حد كبير، الاستدلال على العلاقات المكانية بين الزوائد المتاخمة والشعيرات الدموية الواردة المستمدة من أقسام النسيجي. في هذه الدراسة، تناولنا هذه المسألة بوضع الوسائل اللازمة لتوليد اﻷداءات ثلاثية الأبعاد (3D) للشبكات الشعرية المشيمة البشرية التي تصلح لإجراء تحليلات لميزات الشبكة الشعرية (مثل المنطق التفريعي، صلابة). للقيام بذلك جمعنا بين تلطيخ إيممونوفلوريسسينت مع اثنين من المنتجات إزالة الأنسجة التجارية، فيسيكول-1 وفيسيكول-2 (المشار إليها أدناه كحل-1 والحل-2).
المشيمة البشرية مجمع واسعة من الأوعية الدموية التي تقع في مجال التفاعل بين الدم إينتيرفيلوس الأم والجنين النامي. تمتد خارجاً من أن الإدراج في لوحة المشيمة، الحبل السري وفروع في شبكة من الشرايين والاوردة التي تتشعب لتغطية سطح المشيمة مع وضع شبكة الأوعية الدموية. تحقق غاياتها ثم تخترق أسفل الداخلية أو عمق القرص المشيمة حيث يخضع لعدة أجيال أكثر التفريع وينتهي في الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية الواردة، الموقع لتبادل الغازات، المواد الغذائية، والأيضية النفايات بين دم الأم والجنين.
الإهانات إلى شبكة الشعيرات الدموية المشيمية خلال التنمية عواقب دائمة على صحة الجنين والرضع حديثي الولادة و الكبار الناشئة 1،،من23. ونظرا للأمراض المرتبطة بالحمل مثل الإجهاض، وتقييد النمو داخل الرحم، 4،السكري مقدمات الارتعاج والأمهات5،6 هناك قيمة عالية على وضع أساليب لقياس و توصيف الشبكات الشعرية فيلوس المشيمة. حاجز رئيسي أن شبكات الأوعية الدموية المشيمية تشمل طائفة واسعة من النطاق. يمكن أن تكون شبكات الأوعية الدموية السطحية كبيرة كما 4-5 مم في القطر. الشعيرات الدموية فيلوس المحطة الطرفية يتم بناء على أمر من 10-20 ميكرومتر في القطر؛ تحتوي المشيمة على أكثر من 300 كيلومتر من الأوعية الدموية 7. وفي الوقت الحاضر، هناك تقنيات سهلة الاستخدام وسريعة القليلة التي يمكن التقاط هذه النهايات من حجم السفينة. وحتى الآن، يمكن أن يصبح سوى عدد صغير من الزوائد بالفحص المجهري. على سبيل المثال، جيركوفسكا et al. ركز على الزوائد المشيمية في الأجل، الجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] مع أقسام الضوئية المسلسل على 1 ميكرومتر فترات تم الحصول عليها من 120 ميكرومتر سميكة الأقسام؛ لا توجد بيانات عن عدد العينات التي درست ولا إحصاءات قدمت 8. وحددت هياكل الشعرية، وملامح من الزوائد والشعيرات الدموية كانت مرسومة باليد، مع وسم تصديرها لتحليل الصور. بينما الكتاب مناقشة المترتبة على نتائجها “شبكة الأوعية الدموية فيلوس المتزايد”، هذه الاستنتاجات إشكالية عندما فقط “مصطلح” (36 + الأسبوع الحملي العمر) درس الأنسجة. وبالمثل، مايو كلينيك etلام وبيرس et al. تعتمد على الأنسجة من نفس الفئة العمرية، لهذه المحاكاة لنقل الدم تدفق والأكسجين، ولكن تحليلاتها محدودة لمدة قليلة فقط، الزوائد الطرفية 9،10 . كما طبق ستيريولوجي لدراسة هيكل السفن فيلوس. ولكن مرة أخرى، انصب التركيز عموما على الحمل فيما بعد تسليم الرضع قوبلن مع واحد أو أكثر الحمل مضاعفات 11،12.
حتى وقت قريب، الفحص المجهري [كنفوكل] اقتصر على التصوير إلى أعماق الأنسجة من 100-200 ميكرون بسبب امتصاص إثارة والانبعاثات من الأسفار ب الأنسجة السطحية 13 . على الرغم من إزالة الأنسجة والأنسجة ثلاثية الأبعاد قد وصفت على نطاق واسع في الأدب، وهناك أساليب عديدة لانسجة تطهير العديد غير صالحة للاستخدام مع الأنسجة بشكل عام، كما أنهم لا رجعة فيه الضرر مورفولوجيا الخلوية من خلال هايبرهيدريشن لإزالة الدهون أو البروتينات. ولذلك، من غير الممكن للتحقق من أن هذه النتائج إرشادية للأنسجة نفسها ولا التحف من تجهيز بينما الأنسجة لدينا عملية مسح تقنية عكسها قادرة على التحقق من صحة ضد الأنسجة التقليدية. إزالة الأنسجة عموما ينطوي على إحدى الطرق الرئيسية الثلاث: 1) مطابقة موحدة للانكسار (RI) لمكونات الأنسجة بغمر في حلول مطابقة ري، الذي يزيل بعثرة الخفيفة التراكمية تسبب من لينسينج بسبب استمرار تقلب ري منخفضة (cytosol) ومكونات ري (بروتين/الدهون) عالية؛ 2) إزالة مكونات المادة الدهنية عن طريق التضمين في المائية واستخدام التفريد/نشر لإزالة مكونات الدهون؛ 3) توسيع هيكل البروتين للسماح بزيادة تغلغل المذيبات لتشجيع التوحيد ري 13/تمسخ. في حين أن هذه النهج يمكن أن تجعل الأنسجة شفافة وتسمح بتمثيل ثلاثي الأبعاد للمؤشرات الحيوية توليد، هذه تمثيلات ثلاثية الأبعاد ذات قيمة السريرية مشكوك فيها كما أنها تشكل تحديا لتحديد ما إذا كانت هذه الصور يدل على خصائص الأنسجة أو أنسجة تطهير العملية. من ناحية أخرى، نظراً للأنسجة لدينا مسح عكسها يمكن تطبيق معيار النسيجي و/أو إيمونوهيستوتشيميستري للنسيج نفسه تقييم ما إذا كانت التعديلات الهامة سريرياً.
تقدم هذه الدراسة تحليلاً لعينات فيلوس القاصي 47 التي تم الحصول عليها من إجمالي 23 سريرياً العادية والانتخابية إنهاء الحمل بين 9-23 إتمام أسبوعا من الحمل والشحنتين العادي المدى الكامل. وقد مكن الفلورة وسم تروفوبلست والجهاز إجراء تحليل كمي والآلي من تغييرات في شبكات الأوعية الدموية فيلوس وتعقيدها.
مع هذا البروتوكول، ونحن عزل وتحليل الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية على نطاق لا يمكن سابقا. وسيحدد هذا النهج، عند تطبيقها على تطوير شبكة فيلوس والشعرية عبر الحمل تلك الخصائص التي هي الأساس لولادة طفل سليم. عند تطبيقها على دراسات لحالات الحمل معقدة، فإنه سيوضح أيضا عند وكيفية تعديل الأمراض المشيمية الأشجار فيلوس والشبكات الشعرية أنها غمد، وكيف هذه تؤثر على رفاه الجنين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأقر “المجلس استعراض المؤسسية” جمع الأنسجة فيلوس المشيمية للتثبيت الفورمالين من الانتخابية إنهاء الحمل. قبل الإجراءات التي أجريت، استعراضاً موجزاً للسجل الطبي أشار إلى سن الأمهات، التكافؤ، وأكد عدم وجود أي الطبية الأساسية (مثلارتفاع ضغط الدم، والسكري ومرض الذئبة) أو الجنين (الشذوذ ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد “مكتب نيويورك التابع للدولة” هذا العمل للأشخاص ذوي العاهات الخلقية والمشيمة تحليلات LLC، نيو روشيل، نيويورك.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
