Трехмерные визуализации и анализа полученных, пояснил человеческого плацентарного ворсинчатых сосудистой сети
Summary
Это исследование представляет собой протокол для обратимых ткани, очистка, иммуноокрашивания, 3D-рендеринга и анализа сосудистой сети в плаценте человека Вилли образцах порядка 1-2 мм3.
Abstract
Обмен питательных веществ и газов между матери и плода происходит на стыке intervillous крови матери и подавляющее ворсинчатых капиллярной сети, что делает большую часть паренхимы человеческой плаценты. Дистальная ворсинчатых капиллярной сети является конечной поставки крови плода после нескольких поколений ветвления судов, которая выходит из пуповины. Эта сеть имеет непрерывный сотовой ножнах, слой барьера-синцитиальный трофобласта, который предотвращает смешивание крови плода и материнской крови, в котором он постоянно купались. Оскорбление целостности плаценты капиллярной сети, происходящих в расстройств, таких как матери диабета, гипертонии и ожирение, иметь последствия что настоящему серьезные риски для здоровья для плода, младенцев и взрослых. Чтобы лучше определить структурные последствия эти оскорбления, протокол был разработан для этого исследования, которое захватывает капиллярной сети структуры порядка 1-2 мм3 которой одно может расследовать его топологических особенностей в всей его сложности. Чтобы достичь этого, разделяются кластеры терминала ворсинки от плаценты, и слой трофобласта и капиллярной endothelia полученных. Затем эти образцы уточняются с новой ткани, очистка процесс, который делает возможным приобрести конфокальное изображение стеки для z глубины ~ 1 мм. Затем обрабатываются и анализируются для создания основных капиллярной сети таких мер, как объем, количество капилляров филиалов и капиллярной филиал конечных точек, как проверка пригодности данного подхода для трехмерной визуализации этих стеков характеристика капиллярной сети.
Introduction
Наше понимание развивающихся плаценты и ее патологий в значительной степени ограничивается выведен пространственные отношения между соседними ворсинки и замкнутых капилляров, производный от гистологических срезах. В этом исследовании мы затрагивали этот вопрос путем разработки средств для создания трехмерных (3D) визуализации человеческого плацентарного капиллярных сетей, которые подходят для анализа особенностей капиллярной сети (например ветвления, прочности). Для этого мы объединили, immunofluorescent окрашивание с двух коммерческих ткани очистки продуктов, Visikol-1 и Visikol-2 (именуемых ниже решение-1 и решения-2).
Плаценты человека представляет собой огромный комплекс кровеносных сосудов, расположенный на стыке между intervillous крови матери и развивающегося плода. Которая выходит из его вставки в пластину хорионический, пуповины разветвляется сеть артерий и вен, которые ramify для покрытия хорионический поверхности с разработки сосудистой сети. Их концы затем проникать вниз в интерьер или глубины в плацентарной диска, где они проходят несколько поколений более ветвления и заканчиваются в терминал ворсинки и их содержится капиллярной сети, на сайт обмена газов, питательных веществ, и метаболизм отходов между кровью матери и плода.
Оскорбление плацентарной капиллярной сети во время разработки имеют долгосрочные последствия для здоровья плода, новорожденного и возникающим взрослых 1,2,3. С учетом патологий, связанных с беременностью, таких как выкидыш, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсии и материнской диабет 4,5,6 есть это большое значение уделяется разработке методов измерения и характеристика плаценты ворсинчатых капиллярной сети. Основным камнем преткновения является, что плацентарной сосудистой сети охватывают широкий спектр масштаба. Поверхности сосудистой сети может быть так велика, как 4-5 мм в диаметре. Терминал капилляров ворсинок являются порядка 10 -20 мкм в диаметре; плаценты содержит более 300 км 7кровеносных сосудов. В настоящее время есть несколько прост в использовании и быстрый методы, которые могут захватить эти крайности судна масштаба. На сегодняшний день, только небольшое количество Вилли можно отобразить с помощью микроскопии. Например Jirkovska et al. сосредоточена на плацентарный ворсинок в срок, сочетая конфокальная микроскопия с последовательный оптический секции интервалы 1 мкм, полученные из 120 мкм толщиной секций; нет данных о количестве образцов учился ни статистики были предоставлены 8. Капиллярные структуры были выявлены, и контуры ворсинки и капилляров были рисованной, с прориси экспортированы для анализа изображений. В то время как авторы обсуждения последствий их выводов для «растущий ворсинчатых сосудистой сети», такие выводы являются проблематичными, когда только «термин» (36 + недели гестационного возраста) ткань изучается. Аналогичным образом, Мейо etl. и Пирс et al. полагались на ткани того же возраста, для их имитации крови передачи потока и кислорода, но их анализа были ограничены лишь несколько термин, терминал Вилли 9,10 . Stereology также был применен к изучению структуры ворсинчатых судов. Но опять же, как правило сосредоточены на более поздних беременностей, обеспечивая живорожденных младенцев с одним или несколькими беременности осложнения 11,12.
До недавнего времени, конфокальная микроскопия был ограничен изображений до глубины 100-200 мкм ткани из-за поглощения возбуждения и выбросов флуоресценции вышележащих тканей 13 . Хотя Очистка ткани и 3D гистология широко описаны в литературе и есть множество методов для очистки многих тканей непригодными для использования с тканями в целом, как они необратимо повредить клеточной морфологии через hyperhydration белки или удаление липидов. Таким образом невозможно подтвердить, что эти результаты свидетельствуют о самой ткани и не артефакты из обработки в то время как наши ткани, очистка процесс является обратимым технику, которая сможет проверить против традиционных гистологии. Очистки ткани, как правило, предполагает один из трех основных подходов: 1) единообразные соответствия показателя преломления (RI) ткани компонентов погружение в Ри подходящих решений, который удаляет совокупное рассеяние света вызвало из линзирования благодаря непрерывной колебания низкой ри (цитозоль) и высокой ри (белок/липиды) составляющих; 2) удаление липидных компонентов путем встраивания в гидрогеля и использованием электрофореза/диффузии для удаления компонентов липидов; 3) расширения/денатурации белка структуры разрешить увеличение проникновения растворителей для поощрения единообразия ри 13. Хотя эти подходы можно сделать прозрачной ткани и позволяют 3D представление биомаркеров для создаваемого, эти 3D представления имеют сомнительную ценность клинических как это сложно определить, являются ли эти образы свидетельствует о свойства ткани или из ткани, очистка процесса. С другой стороны поскольку наши ткани очистка является обратимым стандарт гистологические и/или иммуногистохимия могут применяться же ткани для оценки ли клинически значимых изменений.
Это исследование содержит анализ 47 дистальной ворсинчатых образцов, полученных из в общей сложности 23 клинически нормальной и ургентного прекращено беременности между 9-23 полных недель гестации и два нормальных родов полный срок. Этикетировочный иммунофлуоресценции трофобласта и endothelia позволило количественные и автоматизированный анализ изменений в ворсинчатых сосудистой сети и их сложности.
С настоящим Протоколом мы изолированы и проанализированы ранее терминал ворсинки и их капиллярной сети в масштабе не представляется возможным. Этот подход, когда применяется к развитию ворсинок и капиллярной сети по всей беременности будет определять те свойства, которые являются основой для рождения здорового ребенка. Когда применяется для исследования сложных беременностей, он также будет уточнить, когда и как плацентарной патологий изменить ворсинчатых деревья и капиллярной сети, которую они оболочка, и как они посягают на благополучие плода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Институциональных Наблюдательный Совет одобрил коллекции плацентарной ворсинчатых тканей формалином фиксации от ургентного прекращено беременностей. Прежде чем были выполнены процедуры, краткий обзор медицинских записей отметил возраст матери, паритета и подтвердила отсутствие л?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Нью-Йоркского отделения государственного сайта для людей с отклонениями и плацентарной Analytics LLC, Нью-Рошель, Нью-Йорк.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
