Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken
Summary
Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.
Abstract
Nutriënt en gas uitwisseling tussen moeder en foetus treedt op op het grensvlak van de maternale intervillous bloed en het grote villous capillaire netwerk dat een groot deel van de parenchym van de menselijke placenta maakt. De distale villous capillaire netwerk is het eindpunt van de foetale bloedtoevoer na meerdere generaties vertakking van vaartuigen uit afkomstig uit de navelstreng uit te breiden. Dit netwerk heeft een aaneengesloten cellulaire schede, de syncytieel trofoblast barrière laag, waardoor de vermenging van foetaal bloed en het moederlijke bloed waarin het continu baadt. Beledigingen aan de integriteit van de placenta capillaire netwerk, die zich in wanorde zoals moeders diabetes, hoge bloeddruk en obesitas, hebben gevolgen die aanwezig ernstige gezondheidsrisico’s voor de foetus, kinder-, en volwassen. Als u wilt beter definiëren de structurele effecten van deze beledigingen, werd een protocol ontwikkeld voor deze studie die vangt capillaire netwerkstructuur volgorde van 1-2 mm3 waarin een topologische landschapskenmerken in zijn volledige complexiteit kan onderzoeken. Om dit te bereiken, clusters van terminal villi van placenta worden ontleed en de trofoblast-laag en de capillaire endothelia zijn immunolabeled. Deze monsters worden vervolgens verduidelijkt met een nieuw weefsel clearing proces dat het mogelijk maakt te verwerven van de confocal afbeeldingsstapels naar z-diepten van ~ 1 mm. De driedimensionale renderings van deze stapels worden vervolgens verwerkt en geanalyseerd voor het genereren van capillaire basisnetwerk maatregelen zoals volume, aantal capillaire takken en capillaire vertakkingspunten einde, als bevestiging van de geschiktheid van deze aanpak voor de karakterisering van het capillaire netwerk.
Introduction
Ons begrip van de ontwikkeling van de placenta en de pathologieën is, in belangrijke mate beperkt tot ruimtelijke relaties tussen aangrenzende villi en ingeperkt haarvaten afgeleid van histologische secties afgeleid. In dit onderzoek hebben we deze kwestie door de ontwikkeling van de middelen voor het genereren van driedimensionale (3D) renderings van menselijke placenta capillaire netwerken die geschikt voor analyses van capillaire netwerkfuncties (bijvoorbeeld vertakking zijn, stevigheid). Om dit te doen hebben wij gecombineerd immunefluorescentie kleuring met twee commerciële weefsel clearing producten, Visikol-1 en Visikol-2 (hierna aangeduid als oplossing-1 en oplossing-2).
De menselijke placenta is een uitgestrekte complex van bloedvaten, gelegen op het raakvlak tussen de intervillous bloed van de moeder en de zich ontwikkelende foetus. Uit te breiden uit vanaf de invoegpositie in de chorionic plaat, takken de navelstreng in een netwerk van slagaderen en aderen die ramify ter dekking van de chorionic oppervlak met een uitgebreide vasculaire netwerk. Hun doeleinden dan neer in het interieur of de diepte van de placenta schijf waar ze ondergaan verschillende meer vertakkende generaties en eindigen in de terminal villi en hun ingeperkt capillaire netwerken, de site van de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, doordringen en metabole afval tussen foetale en maternale bloed.
Beledigingen naar de placenta capillaire netwerk tijdens de ontwikkeling duurzame gevolgen hebben voor de gezondheid van de foetus, pasgeboren zuigelingen- en de opkomende volwassen 1,2,3. Met het oog op zwangerschap-gerelateerde aandoeningen zoals miskraam, beperking van de uteriene groei, pre-eclampsie en de moeder diabetes 4,5,6 er is een hoge waarde geplaatst op de ontwikkeling van methoden voor de meting en karakterisatie van placenta villous capillaire netwerken. Een grote wegversperring is dat placenta vasculaire netwerken een brede waaier van schaal omvatten. De oppervlakte vasculaire netwerken kunnen worden zo groot als 4-5 mm in diameter. De terminal villous haarvaten zijn over de volgorde van 10 -20 µm in diameter; de placenta bevat meer dan 300 km aan bloedvaten 7. Op dit moment zijn er paar makkelijk te gebruiken en snelle technieken die deze uitersten van de schaal van het vaartuig vangen kunnen. Tot op heden kan slechts een klein aantal villi worden gemaakt door microscopie. Bijvoorbeeld, Jirkovska et al. gericht op de placenta villosités op termijn confocale microscopie combineren met seriële optische secties tussenpozen 1 µm verkregen 120 µm dik secties; 8werden geen gegevens over het aantal monsters studeerde noch statistieken worden meegedeeld. Capillaire structuren werden geïdentificeerd, en contouren van villi en haarvaten waren handgetekende, met schetsen voor beeldanalyse geëxporteerd. Terwijl de auteurs spreken over de implicaties van hun bevindingen voor het “groeiend villous vasculaire netwerk”, zijn deze conclusies problematisch wanneer alleen “term” (36 + week zwangerschapsduur) weefsel wordt bestudeerd. Evenzo Mayo et eenl. en Pearce et al. vertrouwd op het weefsel van dezelfde leeftijd, voor hun simulaties van bloed stroom en zuurstof overdracht, maar hun analyses werden beperkt tot slechts een paar termijn terminal villi 9,10 . Stereology is ook toegepast op de studie van de structuur van villous schepen. Maar nogmaals, de focus is over het algemeen op latere zwangerschappen leveren liveborn zuigelingen met één of meer zwangerschap complicaties 11,12.
Tot voor kort, was confocal microscopie beperkt tot imaging naar weefsel diepten van 100-200 µm vanwege de absorptie van de excitatie en emissie van de fluorescentie door de bovenliggende weefsel 13 . Hoewel weefsel clearing en 3D histologie wijd zijn beschreven in de literatuur en er zijn zijn tal van methoden voor clearing veel weefsel ongeschikt voor gebruik met weefsels in het algemeen, aangezien zij onherroepelijk cellulaire morfologie via de Hyperhydratie beschadigen van proteïnen of verwijdering van lipiden. Daarom is het niet mogelijk om te valideren dat deze resultaten kenmerkend voor het weefsel zelf en niet artefacten zijn uit de verwerking van overwegende dat onze weefsel clearing proces is een omkeerbare techniek welk vermag valideren tegen traditionele histologie. Weefsel clearing in het algemeen gaat om een van drie belangrijke benaderingen: 1) uniforme matching van de brekingsindex (RI) van weefsel componenten door onderdompeling in RI overeenkomende oplossingen, waarbij de cumulatieve lichtverstrooiing veroorzaakt uit lensing toe te schrijven aan continu wordt verwijderd schommelingen van de lage RI (cytosol) en hoge RI (eiwit/lipiden) bestanddelen; 2) verwijderen van lipide onderdelen door middel van inbedding in de hydrogel en met behulp van elektroforese/diffusie Schakel lipide onderdelen; 3) uitbreiding/denaturatie van eiwitstructuur dat toegenomen penetratie van oplosmiddelen te bevorderen van de eenvormigheid van de RI 13. Terwijl deze benaderingen kunnen weefsels transparant maken en toestaan voor 3D voorstellingen van biomarkers moeten worden gegenereerd, zijn deze 3D representaties van twijfelachtige klinische waarde omdat het is uitdagend om te bepalen of deze beelden indicatieve van weefsel eigenschappen of van het weefsel clearing proces. Aan de andere kant, aangezien onze weefsel wissen omkeerbaar is kan standaard histologische en/of immunohistochemistry worden toegepast op de dezelfde weefsel te beoordelen of de wijzigingen klinisch significante zijn.
Deze studie geeft een analyse van 47 distale villous monsters verkregen uit een totaal van 23 klinisch normaal en electively beëindigd zwangerschappen tussen 9-23 voltooide weken dracht en twee voldragen normale leveringen. Immunofluorescentie etikettering van trofoblast en endothelia heeft een kwantitatieve en geautomatiseerde analyse van veranderingen in de villous vasculaire netwerken en hun complexiteit.
Met dit protocol, we geïsoleerd en geanalyseerd terminal villi en hun capillaire netwerken op een schaal niet mogelijk eerder. Deze aanpak, wanneer toegepast op de ontwikkeling van het netwerk van villous en capillaire hele draagtijd zal identificeren die eigenschappen die de Stichting voor de geboorte van een gezond kind. Wanneer toegepast op studies van gecompliceerde zwangerschappen, zal het ook duidelijk maken wanneer en hoe de placenta pathologieën wijzigen de villous bomen en de capillaire netwerken ze schede, en hoe deze foetale welzijn aantasten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De institutionele Review Board goedgekeurd de collectie van placenta villous weefsels voor fixatie van formaline van electively beëindigd zwangerschappen. Voordat de procedures werden uitgevoerd, een kort overzicht van het medisch dossier genoteerd maternale leeftijd, pariteit, en bevestigde de afwezigheid van eventuele onderliggende medische (b.v., hypertensie, diabetes en lupus) of foetale (structurele of chromosomale afwijkingen, abnormale groei) werd uitgevoerd. De technische fiche en elke verzamelde monste…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de New York State Bureau voor mensen met ontwikkelingsstoornissen en placenta Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
