3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히
Summary
이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.
Abstract
영양소와 가스 교환 어머니와 태아 사이 모성 intervillous 혈액 및 많은 인간의 태 반의 실질을 구성 하는 광대 한 villous 모 세관 네트워크의 인터페이스에서 발생 합니다. 원심 villous 모 세관 네트워크는 탯 줄에서 밖으로 확장 하는 혈관의 분기의 여러 세대 후 태아 혈액 공급의 종착역입니다. 이 네트워크에 인접 한 세포 칼 syncytial trophoblast 배리어 층 태아 혈액의 혼합 방지와 모성 혈액에 그것은 지속적으로 목욕을. 장애 산 모 당뇨병, 고혈압, 비만, 등에서 발생 하는 placental 모 세관 네트워크의 무결성에 모욕 그 현재의 심각한 건강 위험 태아, 유아, 및 성인에 대 한 결과 했습니다. 이러한 모욕의 구조적 효과 더 잘 정의 하는 프로토콜 순서를 1-2 m m3 점에서 하나 완전 복잡에 토폴로지 기능을 조사할 수 있다 모 세관 네트워크 구조를이 연구에 대 한 개발 되었다. 이 위해 클러스터 터미널 villi의 태는 해 부, 그리고 trophoblast 레이어 및 모 세관 endothelia immunolabeled. 이 샘플은 다음 공초점 이미지 스택을 ~ 1 m m의 z 깊이를 취득 하는 가능 하 게 하는 프로세스를 삭제 새로운 조직으로 명백 하 게. 이러한 스택 3 차원 렌더링 후 처리 및 분석을 위한이 방법의 적합성의 유효성 검사로 볼륨, 모 세관, 지점과 모 세관 분기 엔드 포인트의 수와 같은 기본 모 세관 네트워크 측정을 생성 하 모 세관 네트워크의 특성화
Introduction
개발 태 반 및 그것의 병 리에 대 한 우리의 이해는, 큰 측정에서 제한 된 인접 villi 조직학 섹션에서 파생 된 포함 된 모세 혈관 사이의 공간 관계를 유추. 이 연구에서 우리 모 세관 네트워크 기능 (예: 분기, 견고)의 분석에 대 한 적합 한 인간의 태 반 모 세관 네트워크의 3 차원 (3D) 렌더링을 생성 하는 수단을 개발 하 여이 문제를 해결 했습니다. 이렇게 하려면 우리는 두 상업 조직 청소 제품, Visikol-1 및 Visikol-2 (이라고 솔루션 1과 솔루션 2) immunofluorescent 얼룩 결합.
인간의 태 반 어머니의 intervillous 혈액 및 태아를 개발 사이의 인터페이스에 위치한 혈관의 광대 한 복합물 이다. 탯 chorionic 접시에 그것의 삽입에서 밖으로 확장, 동맥과 정 맥 ramify 정교한 혈관 네트워크 chorionic 표면을 커버 하는 네트워크로 분기 한다. 그들의 끝 다음 내부 또는 placental 디스크 그들은 몇 가지 더 분기 세대를 받아야 하 고 터미널 villi 및 그들의 포함 된 모 세관 네트워크, 가스, 영양소, 교류의 사이트에서 끝의 깊이에 아래로 침투 및 대사 태아와 모성 혈액 사이 낭비.
개발 하는 동안 태 반 모 세관 네트워크에 모욕 태아, 신생아 유아 및 응급 성인 1,2,3의 건강에 대 한 지속적인 결과 했습니다. 유산, 자궁내 성장 금지 등 임신 관련 pathologies에 비추어 사전 eclampsia 및 모성 당뇨병 4,,56 은 높은 가치 측정 방법 개발에 배치 하 고 placental villous 모 세관 네트워크 특성 주요 장애물은 태 반 혈관 네트워크 규모의 광범위 한 범위를 포함. 표면 혈관 네트워크는 직경에서 4-5 m m로 대단할 수 있다. 터미널 villous 모세 혈관 지름; 10-20 µ m의 순서는 태 반 혈관 7의 300 킬로미터 이상 포함 되어 있습니다. 현재, 선박 규모의 이러한 극단을 캡처할 수 있는 몇 가지 편리 하 고 빠른 기술이 있다. 날짜 하려면, villi 수가 적은 현미경으로 렌더링할 수 있습니다. 예를 들어 Jirkovska 외 에 초점을 맞춘 태 반 모에 용어, confocal 현미경 검사 법을 직렬 광학 섹션 120 µ m 두께 섹션;에서 얻은 1 µ m 간격 결합 공부 하는 샘플도 통계의 수에 데이터 8을 제공 했다. 모 세관 구조 확인 되었다 그리고 villi과 모세 혈관의 윤곽 내보낸 이미지 분석에 대 한 경시와 손으로 그린 했다. 저자, “성장 villous 혈관 네트워크”에 대 한 그들의 발견의 의미를 논의 하는 동안 같은 결론만 “용어” (36 + 주 임신 나이) 조직 공부 때 문제가 있습니다. 마찬가지로, 마요네즈 동부 표준시는l.과 피어스 외. 혈액 흐름과 산소 전송의 그들의 시뮬레이션에 대 한 같은 나이의 조직에 의존 하지만 그들의 분석만 몇 가지 용어, 터미널 villi 9,10 로 제한 되었다 . Stereology는 또한 villous 혈관의 구조 연구에 적용 되었다. 하지만 다시, 포커스는 일반적으로 하나 이상의 임신 합병증 11,12liveborn 유아를 제공 하는 이후 임신에.
최근까지, confocal 현미경 검사 법에 국한 되었다 조직 100-200 µ m의 깊이에 영상 여기의 흡수 및 형광의 방출 overlying 조직 13 . 삭제 하는 조직과 3D 조직학 널리 설명 되었습니다 문학에는 비록 많은 삭제 하는 조직에 대 한 수많은 방법을 적합 하지 않습니다 조직 사용 일반적으로, 그들은 돌이킬 수 없는 hyperhydration 통해 세포 형태학을 손상 단백질 또는 지질 제거. 따라서, 이러한 결과 조직 자체와 우리의 조직 삭제 과정은 가역 기술은 전통적인 조직학에 대 한 유효성을 검사할 수 있는 반면 처리 하지 유물을 나타내는 확인 수는 없습니다. 조직 개간은 일반적으로 세 가지 주요 방법의 한을 포함 한다: 1) 균일 한 일치 하는 조직 구성의 굴절률 (RI)의 연속으로 렌즈에서 발생 하는 누적 빛 산란을 제거 하는 RI 일치 솔루션, 침수 낮은 리 (cytosol) 및 높은 RI (단백질/지질) 성분을;의 변동 2) 하이드로 겔에 포함 및 지질 구성 요소; 제거 하 전기 이동 법/보급을 활용 하 여 지질 구성 요소 제거 3) 확장/변성 단백질 구조를 리 13의 균일성을 장려의 증가 침투를 허용. 이러한 이미지는 조직의 속성을 나타내는 경우 결정 하는 도전으로 이러한 3D 표현은 의심 임상 가치는 이러한 접근 수 조직 투명 렌더링 biomarkers의 3D 표현에 대 한 생성 될 수 있지만 또는 조직의 프로세스를 삭제. 다른 한편으로, 우리의 조직 삭제 가역 이므로 표준 조직학 및 immunohistochemistry 변경은 임상적으로 중요 한 여부를 평가 같은 조직에 적용할 수 있습니다.
이 연구는 9 월 23 일 완료 된 주 임신 및 두 개의 전체 기간 정상 배달 사이 23 임상 정상적이 고 electively 종료 임신의 총에서 얻은 47 원심 villous 샘플의 분석을 선물 한다. 면역 형광 라벨 trophoblast 및 endothelia의 변화 villous 혈관 네트워크 그리고 그들의 복잡성의 양적 및 자동화 된 분석 수 있었습니다.
이 프로토콜, 우리는 절연 하 고 터미널 villi 이전 규모 불가능 그들의 모 세관 네트워크 분석. 임신 villous 및 모 세관 네트워크 개발에 적용 하는 경우이 방법을 건강 한 아이의 탄생에 대 한 기초는 그 속성을 식별 합니다. 복잡 한 임신의 연구에 적용 될 때 또한 때 placental pathologies villous 나무와 그들은 칼 집, 모 세관 네트워크를 수정 하는 방법 및 이러한 태아 복지에 충돌 하는 방법을 명확히 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제도적 검토 보드 electively 종료 임신에서 포 르 말린 고정을 위한 placental villous 조직의 컬렉션을 승인 했다. 의료 기록의 짧은 검토 지적 모성 연령, 패리티, 및 기본 의료 (예:고혈압, 당뇨병, 루 푸 스) 또는 태아 (구조 또는 염색체 이상이의 부재를 확인 절차를 수행 하기 전에 비정상적인 성장) 수행 되었다. 데이터 시트 및 모든 수집 된 표본은 표시만 연구. 따라서, 모든 표본 운영 스위트?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 발달 장애 및 Placental 분석 LLC, 새로운 Rochelle, 뉴욕에 있는 뉴욕 주 사무실에 의해 지원 되었다.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
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