Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem
Summary
Zebrafiskar användes nyligen som ett in vivo -modellsystem för att studera DNA-replikering tidpunkten under utveckling. Här är detaljerad protokollen för zebrafiskar embryon profil replikering timing. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att studera replikering timing i mutanter, enskilda celltyper, sjukdomsmodeller och andra arter.
Abstract
DNA-replikering timing är en viktig cellulär egenskap, uppvisar betydande relationer med kromatinstruktur, transkription och DNA mutation priser. Förändringar i replikering tidpunkten inträffa under utveckling och i cancer, men roll replikering timingen spelar i utveckling och sjukdom är inte känd. Zebrafiskar var nyligen etablerade som en in-vivo modellsystem studera replikering timing. Här är detaljerad protokollen för att bestämma DNA-replikering timing med zebrafiskar. Efter sortering celler från embryon och vuxen zebrafiskar, kan högupplösta genome-wide DNA replication timing mönster konstrueras genom att fastställa förändringar i DNA kopienumret genom analys av nästa generations sekvensering data. Zebrafisk modellen systemet möjliggör utvärdering av replikering timing ändringar som uppstår i vivo hela utveckling, och kan också användas för att bedöma förändringar i enskilda celltyper, sjukdomsmodeller eller muterade linjer. Dessa metoder kommer att möjliggöra studier som undersöker mekanismerna och bestämningsfaktorerna för replikering timing inrättande och underhåll under utveckling, roll replikering timingen spelar i mutationer och uppkomst, och effekterna av störande replikering timing på utveckling och sjukdom.
Introduction
För cellerna att framgångsrikt dela, måste de först noggrant och troget replikera deras hela genomet. Genomet dubbelarbete uppstår i en reproducerbar mönster, som kallas DNA-replikering timing program1. DNA-replikering timing är korrelerad med kromatin organisation, epigenetiska märken och gene expression2,3. Förändringar i replikering timing under hela utvecklingen och är signifikant relaterade till transkriptionell program och ändringar av kromatin märken och organisation4,5. Dessutom replikering timing är korrelerad med mutationsanalys frekvenser, och förändringar i timing observeras i olika typer av cancer6,7,8. Trots dessa observationer, mekanismerna och bestämningsfaktorer replikering timing etableringsrätt och förordning är fortfarande till stor del okända, och rollen den spelar i utveckling och sjukdom är obestämd. Dessutom tills nyligen genome-wide replikering hade timing förändringar som sker i hela ryggradsdjur utveckling endast undersökts i cell kultur modeller.
Zebrafisk, Danio rerio, är väl lämpade att studera replikering timing i vivo under utveckling, som en enda parning par kan ge hundratals embryon som utvecklas snabbt med många likheter med däggdjur utveckling9, 10. Det finns dessutom hela zebrafiskar utveckling, förändringar till cellcykeln, kromatin organisation och transkriptionell program som delar relationer med DNA-replikering timing11. Zebrafisk är också en utmärkt genetisk modell, eftersom de är särskilt mottagliga för manipulation av genmodifiering, mutagenes och riktade mutationer, och genetiska skärmar har identifierat många gener krävs för ryggradsdjur utveckling12. Zebrafiskar kan därför användas att identifiera genernas replikering timing inrättande och underhåll och observera effekterna av avreglera replikering timing på ryggradsdjur utveckling. Transgena linjerna kan också användas för att bedöma replikering timing från enskild celltyper isolerats vid olika utvecklande tidpunkter eller i sjukdomstillstånd. Ännu viktigare, finns det olika zebrafiskar modeller av mänskliga sjukdomar som kan användas för att undersöka betydelsen av replikering timing i sjukdom bildandet och progression9,13,14.
Nyligen, de första replikeringen timing profilerna genererades från zebrafisk, etablerade den som modellsystem studera replikering timing i vivo15. För att åstadkomma detta, samlades celler från zebrafisk embryon på flera stadier av utveckling och i en celltyp som isolerats från vuxna zebrafiskar. Cellerna var sedan sorterade efter FACS (fluorescens-aktiverad cell sortering) baserat på DNA-innehåll att isolera G1 och S fas populationer. Använda G1 provet som en kopia nummer kontroll, kopiera antal variationer i S-fas populationer fastställdes och används för att härleda relativa replikering timing16. Förändringar i replikering timing kan sedan jämföras direkt mellan olika utvecklande prover och celltyper och detta användes för att fastställa förändringar i replikering timing som förekommer i vivo hela ryggradsdjur utveckling. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med andra genomisk metoder, främst att det inte krävs märkning med tymidin analoger eller immunoprecipitation DNA4,6.
Här är detaljerad protokollen till profil genome-wide DNA replication timing på högupplösta i zebrafiskar. Dessa protokoll har använts för att fastställa förhållandena med genetiska och epigenetiska funktioner i zebrafiskar genomet, samt profilering förändringar i dessa relationer som uppstår under hela utvecklingen. Dessa protokoll är även enkelt anpassas för att studera förändringar i replikering timing i mutant stammar av zebrafisk och i sjukdomsmodeller. Dessa metoder ger dessutom en foundation som kan utökas vid att studera replikering timing i specifika celltyper, genom första sortera ut de enskilda celltyper från zebrafiskar. Zebrafiskar kan fungera som en utmärkt i vivo modellsystem studera replikering timing och slutligen avslöja de biologiska funktionerna av denna viktiga epigenetiska drag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafiskar ger en ny och unik i vivo modellsystem studera DNA replication timing. När tidsinställd parningar utförs som beskrivs i detta experimentellt protokoll, tusentals embryon kan samlas i en enda dag för experiment. Dessa embryon utvecklas synkront genom just tidsinställda och distinkt kännetecknas stadier av utveckling. Zebrafiskar kan vara enkelt och korrekt iscensatt av morfologi med ett stereomikroskop, som zebrafisk embryon utveckla externt och är optiskt klart. Detta protokoll Detaljer använ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health genom bidrag 5P20GM103636-02 (inklusive Flow flödescytometri core support) och 1R01GM121703, samt utmärkelser från Oklahoma Center för vuxna stamceller Forskning.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
