使用斑马鱼作为体内模型系统分析 DNA 复制定时
Summary
斑马鱼最近被用作一个体内模型系统, 用于研究开发过程中 DNA 复制的时机。这里详细介绍了使用斑马鱼胚胎来描述复制时间的协议。该协议可以很容易地适应于研究突变体、个体细胞类型、疾病模型和其他物种的复制时间。
Abstract
dna 复制定时是一种重要的细胞特征, 与染色质结构、转录和 DNA 突变率有显著的关系。复制时间的变化发生在开发和癌症的过程中, 但是复制定时在发展和疾病中的作用是未知的。斑马鱼最近建立了作为一个体内模型系统来研究复制时间。这里详细介绍了使用斑马鱼确定 DNA 复制定时的协议。在对胚胎和斑马鱼的细胞进行分类后, 通过对下一代测序数据的分析, 可以通过确定 dna 拷贝数的变化来构建高分辨率的全基因组 dna 复制定时模式。斑马鱼模型系统允许评估在整个开发过程中发生在体内的复制定时变化, 也可以用来评估单个细胞类型、疾病模型或变异线的变化。这些方法将有助于研究在发展过程中复制定时的建立和维护的机制和决定因素, 复制时间在突变和肿瘤发生中的作用, 以及扰动的影响。发展和疾病的复制时间。
Introduction
为了成功地分裂细胞, 他们必须首先准确和忠实地复制他们的整个基因组。基因组复制以可重现的模式出现, 称为 DNA 复制定时程序1。DNA 复制定时与染色质组织、表观遗传学标记和基因表达式2,3相关。复制定时的变化发生在整个开发过程中, 与转录程序和对染色质标记和组织4、5的更改有显著关系。此外, 复制定时与突变频率相关, 并且在不同类型的癌症中观察到时间的变化6,7,8。尽管有这些观察, 复制时机建立和管制的机制和决定因素仍然很不清楚, 它在发展和疾病中所起的作用是未定的。此外, 直到最近, 整个脊椎动物发展过程中的全基因组复制定时变化才在细胞培养模型中进行了研究。
斑马鱼,斑马斑马, 非常适合在开发过程中研究复制定时在体内, 因为单个交配对可以产生数以百计的胚胎, 与哺乳动物开发的许多相似之处迅速发展9, 10。此外, 在斑马鱼的发展, 细胞周期, 染色质组织和转录程序的变化, 共享与 DNA 复制定时11。斑马鱼也是一个优秀的遗传模型, 因为它们特别容易被转基因、突变和目标突变所操纵, 而基因筛发现了脊椎动物发育所需的许多基因12。因此, 斑马鱼可以用来识别复制定时建立和维护的基因, 并观察解除管制复制时间对脊椎动物发育的影响。转基因线也可以用来评估复制时间从个别细胞类型分离在不同的发展 timepoints 或疾病的情况。重要的是, 有各种各样的人类疾病的斑马鱼模型, 可以用来调查复制定时在疾病形成和进展的作用9,13,14。
最近, 第一个复制定时配置文件是由斑马鱼生成的, 将其建立为研究复制定时在体内15中的模型系统。为了实现这一目标, 在发育的多个阶段和与成年斑马鱼分离的细胞类型中, 收集了斑马鱼胚胎的细胞。然后根据 DNA 含量对细胞进行分类, 以分离 G1 和 S 相种群。使用 G1 示例作为副本编号控件, 确定了 S 相位填充的复制数变化, 并用于推断相对复制计时16。然后可以直接比较不同的开发样本和单元格类型之间的复制时间变化, 这用于确定在脊椎动物开发过程中体内发生的复制定时的变化。这种方法比其他基因组方法具有多种优势, 主要是不需要用胸苷类似物或 DNA 的免疫沉淀标记 4, 6.
这里详细介绍了在斑马鱼的高分辨率下对全基因组 DNA 复制时间进行描述的协议。这些协议用于确定斑马鱼基因组和表观遗传特征之间的关系, 以及在整个开发过程中发生的这些关系的变化。这些协议也很容易适应研究斑马鱼突变株和疾病模型中复制时间的变化。此外, 这些方法还提供了一个基础, 可以扩展到研究特定细胞类型的复制时间, 首先从斑马鱼的个别细胞类型排序。斑马鱼可以作为一个优秀的体内模型系统来研究复制时间, 并最终揭示这种重要的表观遗传特征的生物学功能。
Protocol
Representative Results
Discussion
斑马鱼提供了一个新的和独特的体内模型系统来研究 DNA 复制的时间。在这个实验性协议中, 当定时交配执行时, 可以在一天内收集数以千计的胚胎进行实验。这些胚胎通过精确定时和明显特征的发育阶段同步发展。斑马鱼可以很容易和准确地通过形态学使用显微镜, 因为斑马鱼胚胎外部发展, 并在光学上清晰。本议定书详细说明了斑马鱼胚胎在整个脊椎动物发育过程中的复制时机研究。
<…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到国家卫生研究院国立医学研究院的支持, 通过赠款 5P20GM103636-02 (包括流式细胞术核心支持) 和 1R01GM121703, 以及俄克拉荷马州成人干细胞中心颁发的奖项。研究。
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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