DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling
Summary
Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.
Abstract
DNA-Replikation Timing ist eine wichtige zelluläre Eigenschaft, wichtige Beziehungen mit Chromatinstruktur, Transkription und DNA Mutationsraten ausstellen. Änderungen im Zeitplan der Replikation auftreten während der Entwicklung und in der Krebstherapie, aber die Rolle Replikation Timing spielt in der Entwicklung und Krankheit ist nicht bekannt. Zebrafisch entstanden vor kurzem als in Vivo Modellsystem Replikation Timing zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung der Zebrabärbling zur DNA-Replikation Zeitpunkt bestimmen. Nach der Sortierung der Zellen aus Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch, können hochauflösende genomweite DNA Replikation Zeitverzögerungsmuster konstruiert werden, durch die Bestimmung der Veränderungen der DNA-Kopienzahl durch Analyse der nächsten Generation Sequencing-Daten. Der Zebrafisch-Modell-System ermöglicht eine Auswertung der Replikation Timing Veränderungen, die auftreten, während der gesamten Entwicklung in vivo, und kann auch zu Veränderungen in einzelnen Zelltypen, Krankheitsmodelle oder mutierten Linien verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen es Studien untersuchen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Aufbau und die Pflege während der Entwicklung, die Rolle Replikation Timing spielt in Mutationen und Tumorgenese und die Auswirkungen der erkunden Replikation Timing auf Entwicklung und Krankheit.
Introduction
Für die Zellen sich zu teilen erfolgreich müssen sie zuerst genau und treu ihre gesamte Genom repliziert werden. Genom Verdoppelung tritt in einem reproduzierbaren Muster, bekannt als der DNA-Replikation Timing Programm1. DNA-Replikation Timing korreliert mit Chromatin Organisation, epigenetischen Markierungen und Gen Ausdruck2,3. Änderungen im Timing der Replikation treten während der gesamten Entwicklung und sind deutlich Bezug auf transkriptioneller Programme und Änderungen zum Chromatin Marken und Organisation4,5. Darüber hinaus Replikation Timing ist korreliert mit mutagenen Frequenzen, und Änderungen im Timing in verschiedenen Arten von Krebs6,7,8eingehalten werden. Trotz dieser Beobachtungen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Errichtung und Ordnung sind noch weitgehend unbekannt, und es spielt die Rolle in der Entwicklung und Krankheit ist unbestimmt. Darüber hinaus hatte bis vor kurzem die genomweite Replikation timing während der vertebrate Entwicklung auftretende Änderungen nur in Kultur zellmodellen untersucht worden.
Zebrafisch, Danio Rerio, eignen sich gut, Replikation Timing in Vivo während der Entwicklung zu studieren wie ein einzelnes Paarung paar Hunderter von Embryonen, die entwickeln sich rasch mit vielen Ähnlichkeiten zu Säugetier-Entwicklung9hervorbringen kann, 10. Darüber hinaus gibt es während der gesamten Entwicklung der Zebrafisch, Änderungen in den Zellzyklus, Chromatin Organisation und transkriptionelle Programmen, die Beziehungen mit DNA-Replikation Timing11teilen. Zebrafisch sind auch ein hervorragendes genetisches Modell, wie sie sind besonders offen für Manipulation durch Transgenese, Mutagenese und gezielte Mutationen und genetischen Bildschirme haben viele Gene, die erforderlich für vertebrate Entwicklung12identifiziert. Daher kann Zebrafisch, Replikation Timing Aufbau und die Pflege beteiligten Gene zu identifizieren und um die Auswirkungen der Deregulierung Replikation Timing auf vertebrate Entwicklung beobachten verwendet werden. Transgene Linien können auch zur Replikation Timing von einzelnen Zelltypen isoliert an verschiedenen Zeitpunkten Entwicklungsstörungen oder Krankheiten zu beurteilen. Wichtig ist, gibt es verschiedene Zebrafisch Modelle menschlicher Erkrankungen, die verwendet werden, um die Rolle der Replikation Zeitmessung in Krankheit Entstehung und Progression9,13,14zu untersuchen.
Vor kurzem wurden die erste Replikation Timing Profile von Zebrafisch als Modellsystem Replikation timing in Vivo15studieren generiert. Um dies zu erreichen, wurden die Zellen von Zebrafisch-Embryonen in mehrere Phasen der Unternehmensentwicklung und in einem Zelltyp isoliert von Erwachsenen Zebrafisch gesammelt. Zellen wurden dann sortiert nach FACS, die anhand der DNA-Gehalt (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), G1 und der S-Phase-Bevölkerung zu isolieren. Kopieren Sie mithilfe der G1-Probe als eine Nummer Kopiersteuerung Nummer Variationen in S-Phase Populationen wurden ermittelt und verwendet, um relative Replikation Timing16ableiten. Änderungen im Zeitplan der Replikation können dann direkt zwischen verschiedenen Entwicklungsstörungen Proben und Zelltypen verglichen werden, und dies wurde verwendet, um Änderungen im Timing der Replikation zu ermitteln, die in Vivo in vertebrate Entwicklung auftreten. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen genomischen Methoden, vor allem, dass es keine Kennzeichnung mit Thymidin-Analoga oder Immunopräzipitation DNA4,6.
Hier wird detailliert die Protokolle zum Profil genomweite DNA Replikation Timing bei hochauflösenden im Zebrafisch. Diese Protokolle wurden zur Beziehungen mit genomischen und epigenetische Features in das Zebrafish Genom, sowie die Profilierung Änderungen in diesen Beziehungen, die auftreten, während der Entwicklung zu bestimmen. Diese Protokolle sind auch leicht angepasst, um Veränderungen in Replikation Timing im mutierten Zebrafisch-Stämme und in Krankheitsmodellen zu studieren. Darüber hinaus bieten diese Methoden eine Stiftung, die Replikation Timing in bestimmten Zelltypen zu studieren, durch erste Aussortieren der einzelnen Zelltypen aus dem Zebrafisch erweitert werden kann. Der Zebrabärbling dient als eine ausgezeichnete in Vivo Modellsystem zu Replikation Timing zu studieren und letztlich die biologischen Funktionen von dieser wichtige epigenetische Eigenschaft offenbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisch bieten ein neues und einzigartiges in Vivo Modell, DNA-Replikation Timing zu studieren. Wenn zeitliche Verpaarungen erfolgen als detailliert in diesem experimentellen Protokoll, Tausende von Embryonen können gesammelt werden, an einem einzigen Tag für Experimente. Diese Embryonen entwickeln sich synchron durch präzise getimten und deutlich zeichnet sich Phasen der Entwicklung. Zebrafisch kann leicht und präzise durch Morphologie mit einem Stereomikroskop wie Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich na…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health durch gewährt, 5P20GM103636-02 (einschließlich Flow Cytometry-Core-Support) und 1R01GM121703, sowie Auszeichnungen aus dem Oklahoma-Center für die adulten Stammzellen Forschung.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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