Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um die mRNA Ausdruck Biomarker der Knochenhaut-abgeleitete Zellen (PDCs) durch Vitamin C (Vitamin C) und 1,25-Dihydroxy Vitamin D [1,25-(OH)₂D₃] induzierte untersuchen. Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren.

Abstract

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind in einer Vielzahl von Geweben und in zahlreichen Zelltypen, einschließlich Osteoblasten differenzieren. Unter den dental Quellen von MSCs ist der Knochenhaut eine leicht zugängliche Gewebe, die MSCs im Kambium Layer enthalten identifiziert wurde. Allerdings hat diese Quelle noch nicht umfassend untersucht.

Vitamin D₃ und 1,25-(OH)₂D₃ wurden nachgewiesen in Vitro Differenzierung von MSCs in Osteoblasten stimulieren. Darüber hinaus fördert Vitamin C Kollagen-Bildung und Knochen Zellwachstum. Jedoch ist keine Studie die Wirkung von Vitamin D₃ und Vitamin C auf MSCs noch untersucht.

Hier präsentieren wir eine Methode der MSCs aus menschlichen alveoläre Periost zu isolieren und untersuchen die Hypothese, dass 1,25-(OH)₂D₃ Osteoinduktiv Auswirkungen auf diese Zellen ausüben kann. Wir untersuchen das Vorhandensein von MSCs in der menschlichen alveoläre Knochenhaut und Stammzell-Adhäsion und Verbreitung zu bewerten. Zu beurteilen, die Fähigkeit von Vitamin C (als Kontrolle) und verschiedenen Konzentrationen von 1,25-(OH)₂D₃ (10⁻¹⁰, 10⁻⁹10⁻⁸und 10⁻⁷ M), wichtige mRNA Biomarker in zu ändern isolierte MSCs mRNA Expression der alkalischen Phosphatase (ALP), bone Sialoprotein (BSP), Kern-bindende Faktor Alpha-1 (CBFA1), Kollagen-1 und Osteocalcin (OCN) sind mit Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen.

Introduction

Obwohl zahlreiche relevante Techniken in den letzten Jahren entwickelt wurden, Knochen Sie Wiederaufbau bleibt durch mehrere Einschränkungen begrenzt, und schätzen, dass das Ausmaß des notwendigen Wiederaufbaus oft unmöglich ist. Hartgewebe Augmentation ist erforderlich, um ästhetische und funktionelle Ziele zusätzlich eine günstige langfristige Erfolgsquote zu erreichen. Üblichen Methoden für solche Verfahren gehören autologen und allogenen Knochentransplantation, Xenografting und alloplastischer Knochentransplantation. Unter den verschiedenen Arten von Knochentransplantat gelten autogene Knochentransplantate am effektivsten. Jedoch wurden Spender Website Morbidität, kompromittierte Vaskularität und begrenzte Gewebe Verfügbarkeit¹ wesentliche Nachteile für autogene Knochentransplantation. Darüber hinaus wurden allogene Knochentransplantate und Xenotransplantate mit Übertragung von Krankheiten in Verbindung gebracht. Derzeit sind synthetische Knochentransplantate verbreitet, diese Probleme zu lösen. Jedoch mit ihrer mangelnden osteogene Potenzial, haben klinische Ergebnisse unterschiedlich. Materialien wie Zellulose sind verbunden mit Volumen Fluktuation, Infektion und ein Mangel an Stärke.

Knochenaugmentation mit Gewebetechnik hat großes Interesse hervorgerufen. In dieser Technik werden mesenchymaler Stammzellen (MSCs) zunächst zur Osteoblasten Differenzierung fördern die sind dann auf der Website der Verlust von Knochen zu Knochen Reparatur verpflanzt. Dieses Verfahren ist derzeit in der Zelltherapie. Knochenaufbau zu erreichen, indem Sie eine begrenzte Menge an Gewebe zu extrahieren ist einfacher und weniger invasiv im Vergleich mit anderen Methoden.

Die potenzielle Rolle von MSCs als Werkzeug für zellbasierte Therapien, die darauf abzielen, dental Regeneration ist das aufkommende Interesse unter verschiedenen Forschungsgruppen. Studien haben bestätigt, dass MSCs aus den folgenden Arten von Gewebe unterschieden werden können: Knochenmark, adipös, synovial Membrane, Pericyte, trabekulären Knochen, menschlichen Nabelschnur und zahngewebe^2,3. Häufige Quellen von MSCs sind Knochenmark und Fettgewebe zahngewebe. Verglichen mit MSCs aus Fettgewebe und Knochenmark abgeleitet, sind die Vorteile von zahnärztlichen Stammzellen leichte Erreichbarkeit und weniger Morbidität nach der Ernte. Im Vergleich zu embryonalen Stammzellen, MSCs aus zahngewebe abgeleitet erscheinen nonimmunogenic und komplexe ethische Bedenken³zugeordnet sind.

Im Jahr 2006, der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie empfohlen mit folgenden Normen zu MSCs identifizieren: Erstens MSCs muß Befestigung an Kunststoff. Zweitens müssen MSCs für den Oberflächenantigenen CD105, CD73 und CD90 positiv und negativ für die Marker für Monozyten, Makrophagen und B-Zellen neben der hämatopoetischen Antigene CD45 und CD34⁴sein. Als letzte Kriterium, MSCs muss in der Lage, sich in die folgenden drei Arten von Zellen unter normalen Bedingungen in Vitro Differenzierung differenzieren: Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten⁴. Bisher haben sechs Typen von humanen zahnmedizinische Stammzellen isoliert und charakterisiert. Die erste Art wurde isoliert aus menschlichen Pulpagewebe und postnatale Zahnpulpa Stammzellen⁵bezeichnet. Anschließend drei weitere Arten von dental MSCs wurden isoliert und charakterisiert: Stammzellen aus abgestoßene Milchzähne⁶, die Wurzelhaut⁷und der apikalen Papille⁸. Vor kurzem wurden auch zahnmedizinische Follikel abgeleitet⁹, gingival Gewebe abgeleitet¹⁰, dental Knospe Stamm cells(DBSCs)¹¹und periapikalen Zyste MSCs (hPCy-MSCs)¹² festgestellt.

Friedenstein war der erste, MSCs¹³zu definieren. MSCs weisen eine hohe Verbreitung potenzieller und manipuliert werden, um vor verpflanzt wird, zu unterscheiden was darauf hindeutet, dass sie ideale Kandidaten für regenerative Verfahren¹⁰sind.

Obwohl die meisten Studien als eine Quelle von Stammzellen des Knochenmarks verwendet, Periost-abgeleitete Zellen (PDCs) wurden ebenfalls vor kurzem¹⁴verwendet. Das Periost ist leichter zugänglich als Knochenmark ist. Deshalb verwenden wir bei dieser Technik, alveoläre Periost, weitere Einschnitte bei der Operation überflüssig und postoperativen Morbidität bei Patienten zu reduzieren. Das Periost ist das Bindegewebe, das bildet die äußeren Auskleidung der langen Knochen und besteht aus zwei unterschiedlichen Schichten: die äußere Faserschicht bestehend aus Fibroblasten, Kollagen und elastischen Fasern¹⁵, und die innere Zelle-reiche Kambium Schicht in direktem Kontakt mit der Knochenoberfläche. Die Kambium Schicht enthält eine gemischten Zellpopulation in erster Linie Fibroblasten¹⁶, Osteoblasten¹⁷, perizyten¹⁸und einer kritischen Subpopulation identifiziert als MSCs^19,20,21. Die meisten Studien haben berichtet, dass PDCs sind vergleichbar, wenn nicht überlegen, Knochenmark-Stammzellen (bMSCs) im Knochen Heilung und Regeneration^22,23,24. Das Periost ist leicht zugänglich und zeigt hervorragende regenerative Wirkung. Jedoch haben einige Studien auf die Knochenhaut^25,26,27konzentriert.

Über Knochen-Reparatur beinhaltet die aktuelle klinische Praxis die Transplantation von periostalen Vorläuferzellen in unterstützende Gerüste verstärkt. Neuere Studien konzentrierten sich auf Erwerb von Stammzellen in defekten Regionen und Vorläuferzellen für Tissue Regeneration²⁰beschäftigt. Zahnärzte rechnen auch zukünftige Anwendung der parodontalen Knochenregeneration in parodontale Behandlungen und Zahnimplantate. Bezüglich der Entnahmestelle der Knochenhaut leicht durch allgemeine Zahnärzte geerntet werden kann. Günstig im Vergleich gegen Stromazellen Knochenmarkzellen, wie das Periost während routinemäßiger Oralchirurgie zugegriffen werden kann. Somit ist das Ziel dieser Studie, ein Protokoll für die Ernte PDCs zu etablieren und zur Beurteilung der Morphologie, Anlage, Rentabilität und Proliferation von Stammzellen menschlichen Periost.

Vitamin D-Metaboliten der in Vivo Knochen-Mineral dynamischen Gleichgewicht beeinträchtigen. Eine Studie berichtete, dass die 24R,25-(OH)₂D₃ aktive Form von Vitamin D für die osteoblastischen Differenzierung der menschlichen MSCs (hMSCs)²⁸unerlässlich. Knochen-Homöostase und Reparatur sind durch ein Netz von Vitamin D₃ Metaboliten geregelt welche, die 1,25-(Oh)₂D₃ (Calcitriol) das biologisch aktive und relevant bei der Regulierung der Knochengesundheit ist. Vitamin D₃ ist essentiell für Verkalkung²⁹. In einer Studie mit 2-d-alte Kunming weiße Mäuse Embryoid Körper in den Mäusen gezeigt, dass Vitamin C und Vitamin D-Präparate wirksam die Differenzierung der Osteoblasten ESC abgeleitet³⁰gefördert. Unter seinen anderen biologischen Aktivitäten stimuliert 1,25-(OH)₂D₃ die in Vitro Differenzierung von hMSCs zu Osteoblasten, die überwacht werden können, basierend auf dem Vormarsch in Enzym-Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) oder OCN gen Ausdruck.

Einige Studien haben eine Dosis-Wirkungs-Beziehung von kombinierten Behandlungen mit Vitamin C und 1,25-(OH)₂D₃ im menschlichen PDCs mit besonderem Schwerpunkt auf Knochen Gewebe-Engineering entdeckt. In dieser Studie untersuchen wir daher die optimalen Konzentrationen für die einzelnen oder kombinierten Behandlung von 1,25-(OH)₂D₃ und Vitamin C zur Induktion osteogene Differenzierung der menschlichen PDCs. Das Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Zellpopulation, die isoliert von der zahnärztlichen alveoläre Knochenhaut Zellen mit einer MSC-Phänotyp und ob diese Zellen in Kultur (in Vitro) erweitert und differenziert enthält, um das gewünschte Gewebe bilden . Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren. Der zweite Teil der Studie bewertet die Auswirkungen von Vitamin C und 10⁻¹⁰, 10⁻⁹, 10⁻⁸und 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ auf die knochenbildenden Aktivität des PDCs. Das primäre Ziel dieser Studie ist es, die Funktionen von Vitamin C und 1,25-(OH)₂D₃ zu bewerten, während die osteoblastischen Differenzierung des PDCs nach ALP Aktivität und Pro-osteogene Gene, wie ALP, Kollagen-1, OCN, BSP und CBFA1. Darüber hinaus bestimmt dieser Studie die optimale Osteoinduktiv Bedingungen für menschliche PDCs aufbauend auf diesen Erkenntnissen.

Protocol

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital genehmigt. Allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung. (1) Gewebe-Vorbereitung Ernten Sie die periostalen Gewebe von Patienten während der zahnärztlichen Chirurgie (Abbildung 1). Nehmen Sie nach der Klappe Reflexion unter örtlicher Betäubung ein Stück Knochenhaut Gewebe aus der Alveolarknochen mit einer periostalen Se…

Representative Results

Für alle quantitativen Assays werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden durchgeführt mit der Student t-test. Insgesamt 34 Proben stammen, wobei das Durchschnittsalter der Teilnehmer von 48,1 ± 12,3 y. elf dieser Proben wurden von männlichen Patienten und 23 von weiblichen Patienten erhalten. Achtundzwanzig Proben stammen aus den Molaren Regionen und sechs aus den vorderen Regionen; 26 wurden von den Oberkiefer u…

Discussion

Eine neu entwickelte therapeutische Modalität, nämlich Gewebetechnik mit MSCs, hat zahlreiche Vorteile. MSCs, die in verschiedenen Gewebetypen vorhanden sind, sind multipotente Zellen, die in einer Vielzahl von Funktionsgewebe mesodermalen Zellen³⁷ differenzieren können und andere Zellen wie Osteoblasten.

Das Periost dient als eine Nische für Vorläuferzellen und als reiche Gefäßsystem Lieferung für die Knochen umhüllt es³⁸. In unserer St…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt	Sigma	49752
35-mm culture dishes	Corning	430165
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
6  well plate	Corning	3516
Alkaline phosphatase	ABI	Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit	BioVision	K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase	Roche	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
Cell banker1	ZEAOAQ	11888
core binding factor alpha-1	ABI	Hs00231692_m1
dexamethasone	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
indomethacin	Sigma	I7378
insulin	sigma	91077C
insulin–transferrin–selenium-A	Sigma	I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)	Life	4346907
MicroAmp optical adhesive film	Life	4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification	HyClone	SH30265.02
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Permeabilization buffer	eBioscience	00-8333-56
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	Life	4304437
transforming growth factor-β	Sigma	T7039
Trizol reagent (for RNA isolation)	Life	15596018
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
collagen-1	Invitrogen	forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
		reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
		reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP	Invitrogen	forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
		reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers