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Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Published: May 04, 2018
doi:
10.3791/57166
, , ,
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics,Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center,Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center,Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering,Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics,Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine,Taipei Medical University

Summary

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Abstract

Células-tronco mesenquimais (MSCs) estão presentes em uma variedade de tecidos e pode ser diferenciadas em vários tipos de células, incluindo os osteoblastos. Entre as fontes dentais de MSCs, o periósteo é um tecido facilmente acessível, que foi identificado para conter MSCs na camada do cambium. No entanto, esta fonte ainda não foi amplamente estudada.

Vitamina D3 e 1,25-(OH)2D3 foram demonstradas para estimular a diferenciação em vitro de MSCs em osteoblastos. Além disso, vitamina C facilita o crescimento de células de formação e osso de colágeno. No entanto, nenhum estudo ainda investigou os efeitos da vitamina D3 e vitamina C no MSCs.

Aqui, apresentamos um método de isolar o MSCs do periósteo alveolar humano e examinar a hipótese de que 1,25-(OH)2D3 podem exercer um efeito osteoindutivo nessas células. Podemos também investigar a presença de MSCs no periósteo alveolar humano e avaliar a proliferação e a adesão de células-tronco. Para avaliar a capacidade da vitamina C (como um controle) e as diferentes concentrações de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) para alterar a chave biomarcadores de mRNA em expressão de RNAm de MSCs isoladas de fosfatase alcalina (FAL ou ALP), osso sialoprotein (BSP), ligação núcleo fator alfa-1 (CBFA1), 1-colágeno e osteocalcina (OCN) são medidos usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR).

Introduction

Apesar de inúmeras técnicas relevantes têm sido desenvolvidas nos últimos anos, osso restos de reconstrução limitado por várias restrições e estimar que a extensão da reconstrução necessária muitas vezes é impossível. Aumento do tecido duro é necessário para alcançar objetivos estéticos e funcionais, além de uma taxa de sucesso a longo prazo favoráveis. Métodos comumente utilizados para tais procedimentos incluem enxerto ósseo autólogo e alogênico, Xeno e aloplásticos transplante de osso. Entre os vários tipos de enxerto ósseo, enxertos ósseos autógenos são considerados os mais eficazes. Entretanto, a morbidez do local doador, vascularização comprometida e tecido limitada disponibilidade1 foram grandes inconvenientes para enxerto ósseo autógeno. Além disso, enxertos ósseos alogênico e xenografts têm sido associados com a transmissão da doença. Atualmente, enxertos sintéticos são amplamente utilizados para resolver estes problemas. No entanto, com sua falta de potencial osteogênico, desfechos clínicos têm variado amplamente. Materiais, tais como celulose estão associados com a flutuação do volume, infecção e falta de força.

Aumento do osso, usando a engenharia de tecidos tem gerado um interesse considerável. Nesta técnica, as células-tronco mesenquimais (MSCs) inicialmente são utilizadas para promover a diferenciação de osteoblastos, que em seguida são transplantadas para o local da perda óssea para alcançar a reparação óssea. Este procedimento é aplicado atualmente em terapia celular. Alcançar a reconstrução óssea extraindo uma quantidade limitada de tecido é mais simples e menos invasivo em comparação com outros métodos.

O papel potencial do MSCs como uma ferramenta para terapias baseadas em células destinadas a regeneração dentária é um interesse emergente entre vários grupos de investigação. Estudos têm confirmado que MSCs podem ser diferenciados entre os seguintes tipos de tecido: medula óssea, membrana sinovial, tecido adiposa, Pericito, osso trabecular, humano de cordão umbilical e tecidos dentais2,3. Fontes comuns de MSCs incluem a medula óssea, tecido adiposo e tecidos dentais. Comparado com MSCs derivadas de tecido adiposo e da medula óssea, as vantagens das células-tronco dentárias são de fácil acessibilidade e menor morbidade após a colheita. Em comparação com células-tronco embrionárias, MSCs derivados de tecidos dentários aparecem nonimmunogenic e não estão associados com preocupações éticas complexas3.

Em 2006, a sociedade internacional de terapia celular recomendado usando as seguintes normas para identificar MSCs: primeiro, MSCs devem ser capazes de anexar ao plástico. Em segundo lugar, MSCs devem ser positivo para os antígenos de superfície CD105, CD73 e CD90 e negativo para os marcadores de monócitos, macrófagos e células B, além dos antígenos hematopoiéticos CD45 e CD344. Como um critério final, MSCs devem ser capazes de se diferenciar em três tipos de células sob condições padrão de diferenciação em vitro : osteoblastos, condrócitos e adipócitos4. Até à data, seis tipos de células-tronco dentais humanas foram isolados e caracterizados. O primeiro tipo foi isolado do tecido pulpar humano e denominadas de células-tronco de polpa dentária pós-natal5. Posteriormente, três tipos adicionais do MSCs dentais foram isolados e caracterizados: células-tronco de dentes decíduos esfoliada6, o ligamento periodontal7e a papila apical8. Mais recentemente, derivado de folículo dental9, derivado de tecido gengival10, broto dental haste cells(DBSCs)11e cisto periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 também foram identificados.

Friedenstein foi o primeiro a definir MSCs13. MSCs apresentam uma elevado potencial de proliferação e podem ser manipulados para diferenciar-se antes de ser transplantado, o que sugere que eles são candidatos ideais para procedimentos regenerativos10.

Embora a maioria dos estudos usou como fonte de células-tronco da medula óssea, células derivadas de periósteo (PDCs) também têm sido usados recentemente14. O periósteo é mais facilmente acessível, que é a medula óssea. Portanto, nesta técnica, vamos usar o periósteo alveolar para eliminar a necessidade de incisões adicionais durante a cirurgia e reduzir a morbidade pós-cirúrgicas em pacientes. O periósteo é o tecido conjuntivo que forma o revestimento exterior de ossos longos e é composto por duas camadas distintas: a camada exterior fibrosa é composto por fibroblastos, colágeno e fibras elásticas15e a camada interna do cambium célula rica em contato direto com a superfície óssea. A camada do cambium contém uma população de mistura de células, principalmente fibroblastos16, osteoblastos17, pericitos18e uma subpopulação crítica identificado como MSCs19,20,21. A maioria dos estudos têm relatado que PDCs são comparáveis, se não superior, a medula óssea-derivado células-tronco (bMSCs) em osso cura e regeneração22,23,24. O periósteo é facilmente acessível e apresenta excelente eficácia regenerativa. No entanto, poucos estudos têm incidido sobre o periósteo25,26,27.

Em matéria de reparação óssea, a prática clínica atual envolve o transplante de células progenitoras periosteal amplificado dentro apoio andaimes. Estudos recentes têm-se centrado na aquisição de células-tronco em regiões com defeito e empregando células progenitoras para regeneração de tecido20. Dentistas também antecipam a aplicação futura de regeneração óssea periodontal em implantes dentários e tratamentos periodontais. Sobre o site do doador, o periósteo pode ser facilmente colhido por cirurgiões-dentistas gerais. Isto compara-se favoravelmente contra células do estroma da medula, como o periósteo pode ser acessado durante cirurgia oral de rotina. Assim, o objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo para a colheita PDCs e para avaliar a morfologia, apego, viabilidade e proliferação de células-tronco humanas periósteo.

Metabólitos de vitamina D afetam na vivo mineral óssea equilíbrio dinâmico. Um estudo relatou que o 24R,25-(OH) o2D3 a forma ativa da vitamina D é essencial para a diferenciação osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)28. Homeostase óssea e reparação são regulados por uma rede de vitamina D3 metabólitos, dos quais 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) é o mais biologicamente ativo e relevante na regulação da saúde óssea. Vitamina D3 é essencial para a calcificação29. Em um estudo utilizando ratos de Kunming branco 2-d-old, os corpos do embryoid nos ratos indicaram que suplementos de vitamina C e vitamina D efetivamente promovido a diferenciação de osteoblastos ESC-derivado de30. Entre suas outras atividades biológicas, 1,25-(OH)2, D3 estimula a diferenciação em vitro de hMSCs de osteoblastos, que podem ser monitorados com base no aumento na atividade da enzima fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou gene OCN expressão.

Alguns estudos detectaram uma relação dose-resposta de tratamentos combinados com vitamina C e 1,25-(OH)2D3 em PDCs humanos com um foco particular na engenharia de tecido ósseo. Portanto, neste estudo, examinamos as concentrações ideais para tratamento simples ou combinado de 1,25-(OH)2D3 e vitamina C para induzir a diferenciação osteogênica de PDCs humanas. O objetivo do presente protocolo é determinar se uma população de células isolada do periósteo alveolar dental contém células com um fenótipo MSC e se essas células podem ser expandidas em cultura (em vitro) e diferenciadas para formar o tecido desejado . Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. A segunda parte do estudo avalia os efeitos da vitamina C e 10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 sobre a atividade osteogênica do PDC. O principal objetivo deste estudo é avaliar as funções da vitamina C e 1,25-(OH)2D3 durante a diferenciação osteoblástica de PDCs por atividade ALP e genes pro-osteogênica, tais como ALP, CBFA1, OCN, BSP e colágeno-1. Além disso, este estudo determina as condições de osteoindutora ideal para PDCs humanas com base nesses resultados.

Protocol

O protocolo de estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital. Todos os participantes fornecido o consentimento informado por escrito. 1. tecido preparação Colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dental (Figura 1). Após reflexão flap sob anestesia local, pegue um pedaço de tecido do periósteo do osso alveolar usando um separador periosteal31. Após a colheita…

Representative Results

Para todos os ensaios quantitativos, os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o Student t-teste. No total, 34 amostras foram obtidas com uma idade média de participantes de 48,1 ± 12,3 y. onze destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino e 23 do sexo feminino. Vinte e oito amostras foram obtidas a partir das regiões molares e seis das regiões anteriores; 26 foram obtidos de maxila e…

Discussion

Uma modalidade terapêutica recentemente desenvolvida, ou seja tecido de engenharia que impliquem MSCs, tem inúmeras vantagens. MSCs, que estão presentes em diversos tipos de tecido, são células multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de células de tecidos mesodérmicos funcional37 e outras células, como os osteoblastos.

O periósteo serve como um nicho de células progenitoras, e como uma fonte de rica vascularização para o osso envolve-<sup cla…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional para clínicas pesquisa de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 4728B-101 e 103-4223C). Este estudo foi suportado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.

Materials

0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers
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Mesenchymal Stem CellsAlveolar PeriosteumVitamin DOsteogenic ActivityCell IsolationCell CultureBone FormationOsteoinductive Potential

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Citer Cet Article
Wang, Y., Hong, A., Yen, T., Hong, H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).
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