마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법
Summary
환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.
Abstract
여러 최근 연구 인간의 질병 개선에 풍부한 환경에서 생활의 유익한 효과 설명 했습니다. 마우스에서 환경 농축 (EE) tumorigenesis 마우스 면역 시스템을 활성화 하는 것을 줄여 또는 종양 microenvironment에서 향상 된 미생물 다양성을 포함 하 여 상처 복구 응답을 자극 하 여 종양 베어링 동물 생존에 영향을 줍니다. 여기에 마우스 대 장 종양 모델에서 미생물의 생물 다양성에 환경 농축의 효과 평가 하기 위해 자세한 절차입니다 제공. 동물 사육 및 동물 유전자 형 및 마우스 식민지 통합을 위한 고려 사항에 관한 주의 사항 설명, 모두는 궁극적으로 미생물 생물 다양성에 영향을. 이러한 예방 조치를 주의 더 균일 한 미생물 전송, 수 하 고 따라서 연구 결과 혼동 수 비 처리 종속 효과 완화할 것 이다. 또한,이 절차에서는 microbiota 변경 다음 장기 환경 농축 원심 결에서 수집 하는 자에서 분리 된 DNA의 16S rDNA 시퀀싱을 사용 하 여 특징입니다. 본질적인 microbiota 불균형은 염증 성 장 질환과 결 장 암, 뿐만 아니라 비만 및 다른 사람의 사이에서 당뇨병의 병 인에 연관 된다. 중요 한 것은, 다양 한 인간 질병을 정리 할 수 있는 존재 하는 강력한 마우스 모델 질병에서 미생물 병 인의 역할을 연구 하기 EE 및 미생물 분석을 위한이 프로토콜을 활용할 수 있습니다.
Introduction
환경 농축 (EE) 연구 활용 사회적 자극 (대형 주택 새 장, 동물의 더 큰 그룹), 인지 자극 (오두막, 터널, 중첩 물자, 플랫폼) 및 신체 활동 (실행에 영향을 미칠 복잡 한 주택 매개 변수 바퀴)입니다. EE은 질병 개시 및 barbering 유도 탈모 증, 알 츠 하이 머 병을 포함 한 마우스 모델의 다양 한 배열을 사용 하 여 진행에 증가 한 활동 및 사회 및 인지 향상 된 상호 작용의 효과 이해 하는 많은 실험실에 의해 이용 되어 레트 증후군, 그리고 여러 종양 및 소화기 질병 모델1,2,,34,,56.
여러 마우스 모델 콜론 tumorigenesis 쥐에 연구 개발 되었습니다. 아마도 가장 잘 정의 된 모델은 Apc분 마우스. Apc분 마우스 19907, 윌리엄 비둘기의 실험실에서 개발 되었다 그리고 일반적으로 인간 대 장 암 연관 된 APC 유전자에 돌연변이의 마우스 모델 사용 되었습니다. APC 돌연변이 은닉 하는 인간, 달리 Apc분 마우스는 주로 결 장 종양의 아주 드문와 작은 창 자 종양을 개발 합니다. 그러나, Tcf4에 단일 쫓 고 녹아웃 heterozygous 돌연변이와 Tcf4Het 대립 유전자는 훨씬 콜론 tumorigenesis Apc분 대립 유전자8과 결합 될 때 증가 합니다. 최근, 콜론 tumorigenesis의이 마우스 모델 콜론 tumorigenesis6EE의 효과 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 바이스 외에 공부, 남성 및 여성 4 개의 다른 마우스 라인에 EE의 생리 및 phenotypic 효과 (야생-타입 (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + Apc분 / +, 및 Tcf4 Het / + Apc분 / +)) 정의 된. 아마도 가장 흥미로운 발견 EE 크게 둘 다 남성과 여성 결 장 종양 베어링 동물의 수명을 증가 했다. 이 시연 EE 적어도 줄일 수 있습니다 일부 증상의 콜론 tumorigenesis, 연관 및 동물 건강을 개선. 놀랍게도, 남성에서이 향상 된 수명 감소 tumorigenesis의 직접적인 결과 이며 대신 종양 상처 치유 향상 된 미생물 생물 다양성6을 포함 하는 응답의 개시에 연결 했다.
재미 있는 결과 함께 몇 가지 EE 특정 연구 출판 되었습니다. 그러나, 기술적인 관점에서 중요 한 결과 종종 없습니다 다른 실험실에 번역. 매우 복잡 한 문제, 아니라 농축 장치 및 주택 사용, 하지만 또한 침구, 음식, 환기, 번 식, 유전학, 방, 그리고 동물 프로토콜에서 활동은 다른 실험실 간의 동일한 EE 방법론을 유지 요구 사항, 다른 사람의 사이에서9,,1011. 한 예로 어디 동물 안정적으로 통합 마우스 식민지 따라서 유전 배경 및 식단 구성, 비 처리 관련된 효과 피하기 위해 정규화 동물의 통합 이다. 추가로, 많은 전자 연구 질병, 그리고 일반적인 마우스 농업 관행 본질적인 미생물10,12의 구성에 영향을 수 있습니다 방법에 미생물의 중요성의 실현 하기 전에 완료 되었습니다.
제대로 수행 하지 경우 전자에서 번 식 전략 및 동물 배치 스트레스를 증가 시킬 수 있습니다. 이후 EE 연구 다 수의 남성과 여성의 동물과 여러 genotypes 활용, 실험적인 체제 어려울 수 있습니다 결합 될 여러 새끼에서 동물에 대 한 요구를 주어진. 따라서, 한 번 식 및 전략 이유 다른 담가에서 올바른 유전자의 이유 동물의 결합을 위한 허용 하도록 개발 되었다. 이 대 한 기본 근거 새끼 중 microbiota를 정상화 하 고 스트레스를 줄이기 위해 동물 실험 환경으로 이동 하는 때 이었다. 미생물 댐10에서 전달 되었다. 식민지에 미생물 다양성을 제공 하려면 여성 잭슨 실험실에서 구입 하 고 실험9,,1012시작 하기 전에 한 달 동안 식민지에 통합 했다. 더 정상화 미생물 생물 다양성 동물 사이, 여성 공동 사육 이전 지 내게 했다. 번 식, 양육 하는 동안 공동 주택 및 탈출 하는 능력에 따라 간호 새끼 모성 배려13,14, 미생물 정규화를 가능 하 게 발전의 스트레스 수준을 향상. 비-전자를 방지 하기 위해 관련은 미생물에 대 한 효과, 모든 실험 동물의이 공동 주택 방지 한 실험으로 다른 담가에서 여러 남성을 결합할 때 발생 한 전투 및 추가적인 스트레스. 마지막으로, 모든 genotypes의 동물의 동등한 숫자는 연습장에 포함 됐다. 이 genotypes, 전반에 걸쳐 향상 된 microbiota 생물 다양성에 대 한 기회를 제공 하 고 제거 coprophagia (동물의 경향이 자 소비) 또는 전체 연구. 에 가능한 유전자 형 관련 행동 차이의 기여
이 프로토콜은 이전 EE 연구 미생물 연구, 더 균일 한 미생물 인구 수 있도록 microbiota 정규화 microbiota 전송 및 동물 식민지 통합의 알려진된 측면을 포함 하도록 확장 하는 전략을 제공 합니다. 사이 실험 동물. 이러한 예방 조치를 주의 하는 것은 수 비 처리 관련된 microbiota 차이의 연구 결과 혼동 때문 필수적 이다. 제거 하는 비-전자 관련 microbiota 변화 특히 질병 개발 및 진행 하는 동안 microbiota 구성에 EE의 역할을 정의 하는 연구자 수 있게 된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차는 microbiota의 자 정상 또는 종양 동물 베어링의 환경 풍부를 다음에서 분리 된의 분석에 대 한 수 있습니다. 다른 남녀의 genotypes 많은 동물을 얻기 위해 사육을 포함 하는 큰 실험 이기 때문에, 필수적 이다 동물 실험의 시작 전 사이 미생물 정상화 EE 비를 피하기 위해 관련 미생물에 대 한 효과 생물의 다양성입니다.
네브라스카 및 전자 상태 사이의 일관성을 위해 번 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B. 달리는 통계 조언과 국립 암 연구소 수상 P30 CA042014에 의해 지원 되는 이러한 기술 코어에 대 한 액세스에 대 한 유타 대학 생물 통계학 핵심 라이브러리 시퀀싱 및 K. 바우처에 대 한 유타 대학 게놈 코어에는 감사 합니다. 설명 하는 프로젝트는 국립 암 연구소 보조금 P01 CA073992 K01 CA128891와 사냥꾼 암 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
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