Un método para definir los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad de microbioma de Colon en un modelo de Tumor de Colon murino
Summary
Enriquecimiento ambiental (EE) es un entorno de alojamiento de los animales que se utiliza para revelar los mecanismos que subyacen a las conexiones entre el estilo de vida, estrés y enfermedad. Este protocolo describe un procedimiento que utiliza un modelo de ratón de tumorigenesis colon y EE definir específicamente alteraciones en la biodiversidad de la microbiota que puede afectar la mortalidad de animales.
Abstract
Varios estudios recientes han demostrado los efectos beneficiosos de vivir en un ambiente enriquecido en la mejora de la enfermedad humana. En ratones, enriquecimiento ambiental (EE) reduce tumorigenesis activando el sistema inmune del ratón, o afecta a la supervivencia animal de cojinete de tumor mediante la estimulación de la respuesta de reparación de herida, incluyendo diversidad mejorada del microbioma en el microambiente del tumor. Aquí es un procedimiento detallado para evaluar los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad del microbioma en un modelo de tumor de colon murino. Precauciones con respecto a la cría de animales y consideraciones para la integración de Colonia animal genotipo y ratón se describen, que en última instancia afectan biodiversidad microbiana. Teniendo en cuenta estas precauciones puede permitir la transmisión de microbioma uniforme más y por lo tanto aliviará los efectos del no tratamiento dependiente que pueden confundir los resultados del estudio. Además, en este procedimiento, cambios de la microbiota se caracterizan mediante secuenciación de ADNr 16S del ADN aislado de heces recogidas del colon distal tras enriquecimiento ambiental a largo plazo. Desequilibrio de microbiota intestinal se asocia con la patogenia de la inflamatoria intestinal enfermedad y cáncer de colon, sino también de obesidad y diabetes entre otros. Lo importante, este protocolo para el análisis de EE y microbioma puede ser utilizado para estudiar el papel de la patogenesia de microbioma a través de una variedad de enfermedades donde existen modelos de ratón robusto que puede recapitular la enfermedad humana.
Introduction
Estudios de enriquecimiento ambiental (EE) utilizan parámetros complejos de vivienda para afectar la estimulación social (viviendas grandes jaulas, grandes grupos de animales), estimulación cognitiva (chozas, túneles, materiales de anidación, plataformas) y actividad física (correr ruedas). EE se ha utilizado por muchos laboratorios para entender los efectos del aumento de la actividad y mejora las interacciones sociales y cognitivas en el inicio de la enfermedad y la progresión usando una amplia gama de modelos de ratón, incluyendo alopecia inducida por barbería, enfermedad de Alzheimer, El síndrome de Rett y enfermedad tumoral y digestivo varios modelos1,2,3,4,5,6.
Se han desarrollado varios modelos de ratón para estudiar tumorigenesis de colon en ratones. Quizás el modelo más bien definido es el ratón de ApcMin . El ratón de ApcMin fue desarrollado en el laboratorio de William Paloma en 19907y se ha utilizado como un modelo de ratón de mutaciones en el gen APC que están comúnmente asociados con cáncer colorrectal humano. A diferencia de los seres humanos que las mutaciones APC , ApcMin ratones desarrollan principalmente pequeños tumores intestinales, con muy rara ocurrencia de tumores de colon. Sin embargo, un alelo Tcf4Het con una sola mutación heterozigótica de nocaut knockin en Tcf4, enormemente aumenta tumorigenesis de colon cuando se combina con el alelo ApcMin del8. Recientemente, este modelo de ratón de tumorigenesis de colon se ha utilizado para determinar los efectos de la EA en la tumorigénesis de colon6. En el Bice et al. estudio, los efectos fisiológicos y fenotípicos de la EA en machos y hembras de cuatro líneas de ratón diferente (wild-type (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ + ApcMin / +, y Tcf4 Het / + APCMin / +)) se definieron. Quizás el hallazgo más interesante fue que EE aumenta significativamente la vida de hombres y mujeres animales de con tumores de colon. Esto demostró que la EE puede reducir por lo menos algunos de los síntomas asociados con la tumorigénesis de colon y mejorar la salud animal. Notable, esta vida útil mejorada en varones no es consecuencia directa de la tumorigénesis reducida y en su lugar estaba ligado a la iniciación de una respuesta, incluyendo mejorado microbioma biodiversidad6de cicatrización tumor.
Se han publicado varios estudios específicos de EE con resultados interesantes. Sin embargo, desde un punto de vista técnico, resultados importantes a menudo no son traducibles a otros laboratorios. Mantener idénticas metodologías EE entre distintos laboratorios es un tema muy complejo, no sólo por dispositivos de enriquecimiento y vivienda usada, pero también ropa de cama, alimentos, ventilación, cría, genética, actividad en la sala y Protocolo de animales requisitos, entre otros9,10,11. Un ejemplo es la integración animal, donde los animales deben estar estable integrados en la colonia de ratón, por lo tanto normalizar la composición genética del fondo y la dieta, para evitar efectos relacionados no tratamiento. Además, muchos estudios EE se han completado antes de la realización de la importancia de la microbioma en enfermedad y la forma en que las prácticas de cría de ratón comunes pueden afectar la composición del microbioma intestinal10,12.
Colocación de estrategia y animales de cría en EE puede aumentar el estrés si no se realiza correctamente. Desde estudios EE utilizan gran número de animales machos y hembras y varios genotipos, montaje experimental puede ser difícil dado el requisito para los animales de varias camadas para combinarse. Por lo tanto, una cría y destete estrategia fue desarrollado para permitir la combinación de animales destetados del genotipo correcto de diferentes camadas. La razón primaria de esto era normalizar la microbiota entre camadas y a reducir el estrés cuando los animales fueron trasladados al ambiente experimental. El microbioma se transmitió desde la presa10. Diversidad microbiana a la Colonia, las hembras fueron compradas en laboratorios Jackson e integradas en la colonia durante un mes antes de que la experimento comenzó9,10,12. Normalizar más biodiversidad de microbioma entre animales, las hembras fueron alojadas conjuntamente antes de la cría. Después de cría, viviendas comunales durante la crianza y la capacidad para escapar de cachorros de enfermería mejoraron los niveles de estrés de la atención materna13,14, posiblemente favorecer la normalización del microbioma. Para evitar que EE no relacionadas con efectos sobre el microbioma, esta casa común de todos los animales experimentales prevenir estrés adicional y luchando que se produjo cuando la combinación de varios machos de diferentes camadas en una jaula experimental. Finalmente, se incluyeron números iguales de animales de todos los genotipos en las jaulas. Esto proporcionó la oportunidad para la biodiversidad de la microbiota mejorada a través de genotipos y quitado la contribución de coprofagia (tendencia del animal a consumir heces) o posibles diferencias conductuales específicas de genotipo al estudio general.
Este protocolo proporciona una estrategia que amplía estudios previos de EE para incluir aspectos conocidos de la investigación microbioma, incluyendo integración de microbiota animal y transmisión de Colonia para la normalización de la microbiota, para permitir a más poblaciones de microbioma uniforme entre los animales de experimentación. Teniendo en cuenta estas precauciones es esencial debido a la capacidad de tratamiento no relacionados con microbiota diferencias para confundir los resultados del estudio. Eliminación de EE no relacionadas con cambios microbiota permitirá a los investigadores definir específicamente el papel de la EA en la composición de la microbiota durante el desarrollo de la enfermedad y la progresión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento permite el análisis de la microbiota aislada de heces tras enriquecimiento ambiental de normal o de tumor con animales. Porque estos son grandes experimentos que implican la crianza para obtener muchos animales de diversos sexos y genotipos, normalizando el microbioma entre animales antes del inicio del experimento es esencial evitar que EE no relacionadas con efectos sobre el microbioma biodiversidad.
Coherencia entre NE y EE, se lleva a cabo el proceso de cría para asegu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a B. Dalley en el centro de genómica de la Universidad de Utah para la secuenciación de la biblioteca y K. Boucher en el centro de Bioestadística de la Universidad de Utah para asesoramiento estadístico y el acceso a estos núcleos técnicos apoyados por el premio del Instituto Nacional del cáncer CA042014 P30. El proyecto descrito fue apoyado por el nacional cáncer Institute subvenciones P01 CA073992 y CA128891 K01 y la Fundación de cáncer Huntsman.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
