Summary
Her beskriver vi en detaljeret protokol for invasive målinger af hæmodynamiske parametre herunder portal pres, splanknisk blodgennemstrømningen og systemisk Hæmodynamik for at karakterisere portal hypertensive syndrom i rotter.
Abstract
Dette er en detaljeret protokol beskriver invasive hæmodynamiske målinger i cirrhotic rotter til karakterisering af portalen hypertensive syndrom. Portal hypertension (PHT) på grund af skrumpelever er ansvarlig for de mest alvorlige komplikationer hos patienter med leversygdom. Det fulde billede af portalen hypertensive syndrom er karakteriseret ved øget portal pres (PP) på grund af øget intrahepatisk vaskulære modstand (IHVR), hyperdynamisk omsætning og øget splanknisk blodgennemstrømning. Progressive splanknisk arteriel vasodilatation og øget minutvolumen med forhøjet puls (HR), men lavt arterielt tryk præger portal hypertensive syndrom.
Nye behandlingsformer er i øjeblikket udvikles det mål at reducere PP af enten målretning IHVR eller øget splanknisk blodgennemstrømning — men bivirkninger på systemisk Hæmodynamik kan forekomme. Således, en detaljeret karakterisering af portalen venøse, splanknisk og systemisk hæmodynamiske parametre, herunder måling af PP, portalen veneblod flow (PVBF), mesenteriallymfeknuderne arterielt blod flow, MIDDEL-arterielt tryk (kort) og HR er nødvendig for prækliniske evaluering af effekten af nye behandlinger for PHT. Vores video artikel giver læseren med en struktureret protokollen udfører invasive hæmodynamiske målinger i cirrhotic rotter. Navnlig, vi beskriver kateterisation af arteria femoralis og Vena via en ileocolic vene og måling af portalen venøse og splanknisk blodgennemstrømningen via perivascular Doppler-ultralyd flow sonder. Repræsentative resultater af forskellige rotte modeller af PHT er vist.
Introduction
PHT er defineret som patologisk forhøjet blodtryk i portalen venøse system, der kan forårsage alvorlige komplikationer hos patienter med cirrose som variceal blødning og ascites1. Mens præ hepatisk (fx, portalen venetrombose) og post hepatisk (fx, Budd-Chiari-syndrom) PHT er sjældne, intrahepatisk PHT på grund af levercirrose repræsenterer den mest almindelige årsag til PHT2.
I levercirrose øges PP primært som følge af forhøjet IHVR3. I fremskredne stadier, PHT forværres af den øgede PVBF på grund af øget minutvolumen og faldt systemiske og splanknisk vaskulære modstand – definere portal hypertensive syndrom4. Ohms lov (Δp = Q * R) indebærer, at IHVR og blood flow er proportional med PP5. Hos patienter er direkte måling af PP risikabelt og ikke rutinemæssigt udføres; i stedet, den hepatiske venøs trykgradient (HVPG) bruges som et indirekte mål for PP6,7. HVPG er beregnet ved at fratrække den gratis hepatisk venetryk (FHVP) fra den kilet hepatisk venetryk (WHVP), der måles ved hjælp af en ballonkateter placeret i en leverens vene8. Den fysiologiske HVPG svinger mellem 1-5 mmHg, mens en HVPG ≥10 mmHg definerer klinisk signifikant portal hypertension (CSPH) og viser øget risiko for PHT-relaterede komplikationer, såsom variceal blødning, ascites og hepatisk encefalopati9 . Selv om PP (dvs.HVPG) er den mest relevante parameter for PHT sværhedsgraden, oplysninger om andre komponenter af PHT, herunder sværhedsgraden af hyperdynamisk omsætning (HR, kort), er splanknisk/mesenteriallymfeknuderne arterielt blod flow, og IHVR, afgørende for få en bred forståelse af de forskellige underliggende mekanisme i PHT.
Således, i modsætning til indirekte målinger af PP i mennesker, metoden indført for rotter tilbyder fordelen ved en direkte måling af PP og giver mulighed for optagelse af yderligere hæmodynamiske parametre kendetegner portal hypertensive syndrom. Derudover direkte måling af PP er en fremragende Integrativ udlæsning af mængden af leverfibrose (en vigtig faktor for IHVR) og overvinder visse begrænsninger af fibrose kvantificering relateret til levervæv stikprøvefejl.
De mest almindeligt anvendte gnavere modeller af cirrhotic PHT omfatter kirurgisk galdegang ligatur (BDL), toksin-induceret leverskade (dvs.af tetrachlormethan, thioacetamide eller dimethylnitrosamine administration) og kost-induceret metaboliske leveren sygdomsmodeller. Prehepatic (ikke-cirrhotic) PHT kan være fremkaldt af delvis portåren ligatur (PPVL)10.
Små gnavere er velegnet til metoden præsenteres, herunder mus, hamstre, rotter eller kaniner, og er forbundet med relativt lave vedligeholdelsesomkostninger. På trods af at alle de hæmodynamiske vurderinger er muligt at udføre i mus, bedre nøjagtighed og reproducerbarhed af resultaterne ses med rotter eller større gnavere på grund af den åbenlyse fordel af dyrenes størrelse. Derudover specifikke mikro-instrumenter og enheder er nødvendig for at opnå lignende hæmodynamiske parametre i mus. Endelig, rotter er mere robuste med lavere tilknyttede sygelighed og dødelighed og således, at frafaldsprocenten er sandsynligvis lavere i rotter end i mus.
Den præsenterede metode er velegnet til at vurdere specifikke behandlinger af leversygdom (dvs., anti-fibrotisk eller anti-inflammatoriske lægemidler) eller roman farmakologiske metoder at indflydelse vaskulære tone og/eller endotel biologi; og dermed, sandsynlige virkninger hæmodynamiske parametre i PHT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den etiske komité i den medicinske universitet i Wien og den østrigske Ministeriet for videnskab, forskning og økonomi (BMWFW). Procedurer skal udføres under aseptiske forhold i en operation room eller lignende ren arbejdsområde, da de hæmodynamiske målinger repræsenterer kirurgiske indgreb. Generelt anbefales arbejder i sterile forhold. Når du bruger et inhalation anæstesi, overveje passende ventilation af kirurgi rummet for arbejdssikkerhed. En periode på 40 – 50 min./dyr har betragtes i tilfældet alle hæmodynamiske udlæsninger præsenteret i denne protokol.
1. præ-kirurgisk præparater
- Tænde og kalibrerer elektroniske multikanals optageren herunder Tryktransducere efter fabrikantens anvisninger.
- Tilsluttes bro forstærker ultralyd flow sonder (1 mm og 2 mm).
- Forberede et reservoir af sterilt fysiologisk saltvand løsning, opvarmes til kropstemperatur, 37 ° C, til fugtning væv eller gaze komprimerer.
- Post dyrets vægt vægt-justeret anæstesi og normalisering af hæmodynamiske parametre efter kropsvægt.
- Forberede alt udstyr til et inhalation anæstesi.
Bemærk: Hvis inhalation anæstesi og/eller nødvendige udstyr ikke på stedet eller gennemførlig, så indsprøjtning anæstesi ved hjælp af ketamin og xylazin kan bruges (80 – 100 mg/kg ketamin med 5-10 mg/kg xylazin i fysiologisk kogsaltopløsning løsning, intraperitoneal (i.p.)). En ny dosering af ketamin (reduceret dosis på 20-30 mg/kg, intramuskulær (i.m.)) efter 30-45 min er nødvendig for at fremkalde kontinuerlig kirurgisk-plane anæstesi. - Aflive dyret under kortfristede isofluran anæstesi ved hjælp af en induktion boks til inhalation anæstesi (5 min, 5% v/v isofluran, 3-4 L O2-flow). Omhyggeligt vippe boksen og kontrollere dybde af anæstesi ved immobilitet status af dyret.
-
Intubate rat med en egnet self-made endotrakealtube.
Bemærk: For personale, der er nye til intubation teknik, analgesi/anæstesi (trin 1,10) kan gives lige efter kort sigt inhalation anæstesi til at give ekstra tid for intubation. En anden mulighed er en dyr-specifikke ansigtsmaske til inhalation anæstesi.- Bruge en self-made endotrakealtube fra en modificeret Perifer venøs kateter (14 G). Afbrød håndtering vinger og anbringer en selvklæbende tape loop til posterior fiksering til rottens frækhed at forhindre dislokation af endotrakealtube (figur 1A).
- Bruge en self-made guide wire enhed fra en modificeret arteriel kanyle som en guide wire indehaveren og en passende stump spids wire (figur 1B).
- Brug en passende intubation skrivebord for korrekt placering af dyret. Placere dyret i den liggende stilling med hovedet i en vinklet position.
Bemærk: Hvis ingen intubation skrivebord er tilgængelig, er det muligt at placere dyret i liggende stilling med halsen omhyggeligt strakte sig over bordets kant. Denne procedure anbefales dog ikke på grund af øget risiko for skader. - Lave en sutur bag fortænderne på den ene side af rotter, og forsigtigt strække dyrets hals ved at binde suturen på anden siden (figur 1 c).
- Belyse området pre trakeal ventrale krave af en fokuseret lysstråle. Især i albino dyr, sikre at stemmebåndene er belyst gennem huden til at give mulighed for bedre visualisering og hurtige intubation.
Bemærk: Brug en dyr-specifikke laryngoscope for intubation af pigmenterede dyr. - Få fat i tungen og træk det forsigtigt ved hjælp af to fingre.
- Brug en vatpind, der er behandlet med lidocain (pumpe spray) til omhyggeligt bedøver området larynx.
- Intubate dyret ved at indsætte endotrakealtube mellem vokal folder og ind i luftrøret, ved hjælp af støtte fra guide wire enhed (fig. 1 d).
- Fjerne guide wire enhed.
- Tilslut røret til ventilator.
- Start ventilator ved hjælp af passende indstillinger for dyret (1 L/min O2-Flow, Auto Flow = 90/min; inspiratory pres: 18 mmHg; PIP: 3 mmHg, jeg / E = 1:2) og check for korrekt intubation.
Bemærk: Hvis inflationen i maven er bemærket, fjerne røret og prøv igen. Derudover sammenligner den respiratoriske aktivitet til ventilator rytme eller Placer to fingre på maven væggen lige over maven til at vurdere potentielle inflation i maven.
- Start isofluran anæstesi på 0,5 – 1,0% v/v og 1 L/min O2-Flow umiddelbart efter vellykket intubation (figur 2A).
- Fix det endotrakealtube ved en transbuccal sutur gennem kinden og anbragt selvklæbende tape loop af røret.
- Administrere yderligere anæstesi og analgesi ved to 1 mL sprøjter, fx, ketamin (100 mg/kg) i.p. (23 G kanyle) [eller i.m. ved at distribuere den injicerede volumen (dosis) i bilaterale injektioner i de caudale lårmuskel (30 G kanyle)] og piritramide (2 mg/kg) af subkutant (s.c.) injektion (23 G kanyle). Bemærk det maksimale omfanget af i.m. injektioner pr. injektionsstedet (figur 2B).
- Anvende øjet salve. Klip kropsbehåring på maveregionen og både inderlår. Desinficere huden.
Bemærk: Begge inderlår bør være glatbarberet mulighed for at bruge de kontralaterale femorale arterie for HR og kort målinger i tilfælde af kateterisation af arteria femoralis mislykkedes på den ene side. Barbering på et senere tidspunkt kan forårsage hår til at forurene det kirurgiske felt. - Fix dyret i den liggende stilling på en varmepude (38 ° C) med tape (figur 2 c).
- Overvåge kropstemperatur dyrets kontinuerligt, fxved hjælp af en rektal temperatur sonde (figur 2D).
- Vurdere anæstesi dybde af låget lukning refleks og tå-knivspids-test forud for ethvert indgreb eller operation.
2. måling af HR og kort
- Incise huden på inderlåret (Vælg én side) ovenfor formodet placeringen af arteria femoralis ved at løfte huden af væv pincet og fjerner et hudområde på ca 2 cm længde af Mayo saks (figur 3A).
- Udsætte og ligefremt dissekere arterie-vene-nerve kompleks, som omfatter arteria femoralis fra bindevæv (adventitia) ved at gentagne gange åbne en hemostat langs komplekset.
- Dissekere arterie-vene-nerve kompleks fra det omgivende væv langs ~1–1.5 cm (figur 3B).
- Om nødvendigt fjernes subkutan/perivascular fedt for et bedre overblik og dissektion.
Bemærk: Vær forsigtig, når du fjerner subkutan/perivascular fedt af kutikula saks, da såret blodkar kan forårsage blødninger. Hvis blødningen er bemærket, lægge pres på området blødning ved hjælp af en lille gaze eller stoppe blødningen ved en hemostat. - Adskille arteria femoralis fra femoral vene og nerve med to høj præcision 45° vinkel bred punkt pincet (overveje at femorale venen er den mest mediale struktur og arteria femoralis ligger mere lateral) (figur 3 c-F).
- Placer en ligatur på arteria femoralis så distalt som muligt og bruge en buet klemme på sutur til at anvende blid langsgående trækkraft til femoralis arterie.
- Placer en anden pre knyttede (men ikke lukkede knude) sutur på arteria femoralis som proksimalt som muligt (figur 3 g).
- Forberede et passende kateter (PE-50 for rotte femorale arterie) med en skrå (~ 45°) cut-off tip skylles med heparinized sterilt fysiologisk saltvand løsning (5 mL sprøjte og 23 G stump kanyle). Sikre, at ingen luftbobler er inde i kateteret som de hæmmer arterielt tryk og HR udlæsning (figur 3 H).
- Komprimere arteria femoralis på den proksimale ende af udsatte afsnittet Brug af en micro klemme for midlertidigt at stoppe arterielt blod flow (figur 3I).
- Perforere arterievæggen på en distal placering i afsnittet dissekeret ved hjælp af et bøjet kanyle (23 G) samtidig med at placere en understøttende mikro metal spatel nedenunder arteria femoralis (figur 3J).
- Omhyggeligt catheterize arteria femoralis gennem perforering med den skrå spids af kateteret vender opad. Advance kateteret indtil den mikro klemme er tilnærmet (figur 3 K).
Bemærk: I tilfælde af forgæves kateterisation af arteria femoralis på første prøve, et mere proksimale andet forsøg kan udføres (begynde på trin 2.8). Hvis arterie brud eller svær blødning opstår, ligate eller klemme arterie så proksimalt som muligt for at forhindre yderligere blodtab af. Hvis blodtab er minimal, forsøger catheterizing de kontralaterale femorale arterie (begynde på trin 2.1). - Åbn mikro klemme og check for pulsatile arterielt blod flyde ind i kateteret (figur 3 L).
- Forhindre yderligere tilstrømning af blod i kateteret ved at blokere udstrømning af kateteret.
- Rette kateteret i dens intraluminal placering ved at lukke de forberedte proksimale ligatur omkring arteria femoralis og indførte kateteret (figur 3 M).
- Skyl og Opsug kateter i arteria femoralis at vurdere korrekt intravaskulær placering flere gange. Arteriel pulsering i kolonnen i indsugning blod bør være let synlige.
- Fastsætte kateter placeringen langs fartøjet ved hjælp af enderne af den distale ligatur at forhindre dislokation og sikre en langsgående position af kateter (figur 3N).
- Derudover tape kateter tæt på dyret på kirurgisk bordet for at sikre det og forhindre utilsigtet dislokation.
- Tilslut kateteret fyldt med fysiologisk saltvand løsning til tryktransduceren samtidig undgå dannelsen af luftbobler.
- Starte optagelsen HR og kort ved hjælp af digital interface (figur 3O).
- Dække det udsatte område på inderlåret med en lille fugtede gaze komprimere (figur 3 P).
- Beregn hyperdynamisk (HD) indeks: HD = kort/HR.
Bemærk: I avancerede PHT, HD-indekset er forhøjet i forhold til ikke-portal hypertensive dyr. Imidlertid kunne en stigning i HD index under operationen også tyde på blødning, hypovolæmi eller smerte. Hvis registrerede kort værdier er meget lav, men signalet er god og pulsatile flow registreres i kateteret, kontrollere, om niveauet for anæstesi og potentielt reducere niveauet af anæstesi. Må ikke helt stoppe isofluran anæstesi, da dette kan føre til utilstrækkelig anæstesi dybde dyrevelfærd og god videnskabelig praksis.
3. overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie Blood Flow (SMABF)
-
Udføre en median laparotomi (figur 4A-C)
- Løft huden lag med væv pincet 5 – 6 cm under formet som et sværd og fjerne en tynd strimmel af huden ved hjælp af en Mayo saksen over linea alba indtil formet som et sværd er nået.
- På midten hud indsnit, løft det muskulære lag af væv pincet langs linea alba til at skabe afstand mellem bugvæggen og splanknisk organer.
- Åbn bughulen ved incising den abdominale væg med en skalpel på linea alba. Udvide åbningen mens du løfter den abdominale væg af væv pincet med en Metzenbaum saks langs linea alba over den samme afstand som huden lag.
- Omhyggeligt udgrave tarmen ved hjælp af våde vatpinde med udgangspunkt i coecum og placere den på en stor gaze komprimere gennemblødt i sterilt fysiologisk saltvand løsning ved siden af indsnit (figur 4D-F).
- Wrap tarmen ind i gaze komprimere og sørg for, at det er fugtet med sterilt fysiologisk saltvand løsning (figur 4 g).
- Finde og afsløre den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie.
- Dissekere den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie med to self-made stump 'Schwabl'-kroge: løft arterie med den første krog og forsøge at placere den other sig gennem tunnelen under samme væv. Udsætte den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie langs en 5 mm afstand at sikre flow sonde (1 mm) kan placeres rundt om det (figur 4 H-K).
Bemærk: Hvis det foretrækkes, en præcision 45° vinkel bred punkt pincet kan bruges til at løfte arterien. 'Schwabl'-kroge er fremstillet af 30 G cannulas med stumpt brudt tips bøjet til en krog figur. Hvis sikkerhedsstillelse arterierne er omfattende, 'Schwabl'-kroge kan være sikrere som blødninger fra soeskende mens dissekere den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie kan undgås. Hvis der opstår blødning under klargøringen af den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie, placere en lille gaze komprimere på webstedet blødning i 1-2 min. med blide tryk. Lille blødning vil normalt stoppe hurtigt; altid holde i tankerne til fugtning væv med jævne mellemrum (trin 1,12). Hvis den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie, selv er skadet, skal de hæmodynamiske vurderinger afsluttes. - Anvende ultralyd gel til ultralyd flow sonden sensor og knytte den til den splanknisk mesenterica arterie. Tilpasse det til den naturlige vej af den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie (figur 4L-M).
- Luk flow sonde (1 mm) og om nødvendigt forsigtigt anvende supplerende ultralyd gel på Doppler sensoren til at forbedre signalkvaliteten. Gøre dette ved hjælp af en sprøjte (20 mL) fyldt med ultralyd gel og en stump spids kanyle (18 G) (figur 4N-O).
Bemærk: Hvis strømmen sonden ikke er godt justeret langs den naturlige løbet af fartøjet, spændinger kan forårsage vaskulær konstriktion og dermed turbulent strømning, som reducerer nøjagtigheden af flow målinger. Prøv at re justere retningen af flow sonden langs den naturlige vej af fartøjet og så tilstrækkeligt lave flow sonden i en passende holdning. - Måle SMABF og vurdere overensstemmelse af pulsatile flow signal til systolisk toppene af den femorale arterie optagelse.
Bemærk: Hvis registrerede kort værdier er meget lav, men signalet er god og pulsatile flow registreres i kateteret, kontrollere, om niveauet for anæstesi og reducere potentielt niveauet af anæstesi. Må ikke helt stoppe isofluran anæstesi, da dette kan føre til utilstrækkelig dybde af anæstesi efter dyrevelfærd og god videnskabelig praksis. - Finde en stabil stilling af flow-sonde (1 mm) og fix kabel af flow sonden. Starte optagelsen SMABF uden yderligere manipulation af flow-sonde (1 mm) (figur 4 P).
4. PVBF
- Find og udsætte Vena på den dorsale ansigt af mesenteriet, der er tæt på leveren hilum (figur 5A).
- Forsigtigt dissekere portalen vene fra det omgivende væv ved hjælp af en høj præcision 45° vinkel bred punkt pincet: isolere Vena ved forsigtigt og gentagne gange at skubbe pincet under portåren til at oprette en væv tunnel (figur 5B).
Bemærk: Hvis der opstår en blødning fra periportal væv samtidig med at forberede Vena, anvende blide tryk på webstedet blødning i 1-2 min. ved hjælp af en vatpind; Dette stopper ofte blødningen. - Forstørre tunnelen ved at åbne høj præcision 45° vinkel bred punkt pincet langsomt og udsætte portåren langs en afstand af 5-6 mm til at tillade placeringen af perivascular flow sonde (2 mm) (figur 5 c, D).
- Anvende ultralyd gel til ultralyd flow sonden sensor og vedhæfte det til portal vene på linje med sin naturlige rute (figur 5E).
- Luk flow sonde (2 mm) og anvende yderligere ultralyd gel hvis det er nødvendigt, som tidligere beskrevet (skridt 3.7) (figur 5F).
- Sørg for flow sonden er placeret i en ikke-prekære måde omkring Vena (figur 5 g).
Bemærk: Hvis strømmen sonden ikke er godt justeret langs den naturlige løbet af fartøjet, spændinger kan forårsage vaskulær konstriktion og dermed turbulent strømning, som reducerer nøjagtigheden af flow målinger. Prøv at re justere retningen af flow sonden langs den naturlige vej af fartøjet og så tilstrækkeligt lave flow sonden i en passende holdning. - Finde en stabil stilling af flow sonde (2 mm) og fix kabel af flow sonden. Derefter starte optagelsen PVBF (figur 5 H).
Bemærk: Hvis registrerede kort værdier er meget lav, men signalet er god og pulsatile flow registreres i kateteret, kontrollere, om niveauet for anæstesi og reducere potentielt niveauet af anæstesi. Må ikke helt stoppe isofluran anæstesi, da dette kan føre til utilstrækkelig dybde af anæstesi efter dyrevelfærd og god videnskabelig praksis.
5. PP
- Forberede et kateter (PE-50 for rotte mesenteriallymfeknuderne vener) med en skrå (ca 45°) cut-off tip, der er skyllet med sterilt fysiologisk saltvand løsning (5 mL sprøjte og stumpe 23 G kanyle). Være opmærksomme på, at ingen luftbobler inde i kateteret som de hindrer PP udlæsning (figur 6A).
- Håndtere tarmen med våde handsker og sted det spredt på tværs af fingrene (fig. 6B).
- Optimere visningen af mesenteriallymfeknuderne vaskulære sengen tæt på tyndtarmen (figur 6 c).
- Identificere de vigtigste venøs mesenteriallymfeknuderne skibe fører til portåren (vena ileocolica - vena mesenterica superior - vena portae).
- Find en egnet krydset af den ileocolonic vene, der er tilgængelige for kateterisation.
- Først holde kateteret ind mesenteriallymfeknuderne vævet af perforering af visceralt bughinden af mesenterium tæt på vaskulær vejkryds valgt for kateterisation.
- Omhyggeligt rykke den skrå spids af kateteret tættere til en krydset af ileocolic vene indtil et lille indtryk af fartøjet krydset ses (figur 6D).
- Endelig catheterize det venøse system i overensstemmelse med ruten forbinder fartøj ved perforering vaskulære væggen i passage vinkel på fartøjerne. (Figur 6E).
Bemærk: Hvis der opstår blødning på kateterisation af ileocolic vene, ved hjælp af en tommelfinger presse med en lille gaze komprimere på blødende område. Denne pression bør opretholdes for 1-2 min til at stoppe blødningen. Bagefter, forsøg at indsætte kateteret på en mere proksimale gren af ileocolic vene. - Rykke kateteret omhyggeligt yderligere langs ruten vigtigste venøs fartøj til Vena uden perforering vene (figur 6F).
Bemærk: Hold kateteret en tilstrækkelig afstand til flow sonden anbringes omkring den vigtigste gren af Vena at undgå artefakter i flow-signal og undgå perforation af Vena. - Tilslut kateteret fyldt med fysiologisk saltvand løsning til tryktransduceren samtidig undgå dannelsen af luftbobler.
- Starte optagelsen PP.
- Optage alle hæmodynamiske parametre samtidigt under stabile betingelser for flere min (figur 6 g, H). Valgfrit, portalen venøse kateteret kan fastgøres på plads ved hjælp af væv lim og tarmene kan være flyttet ind i bughulen.
Bemærk: Hvis registrerede kort værdier er meget lav, men signalet er god og pulsatile flow registreres i kateteret, kontrollere, om niveauet for anæstesi og reducere potentielt niveauet af anæstesi. Må ikke helt stoppe isofluran anæstesi, da dette kan føre til utilstrækkelig dybde af anæstesi efter dyrevelfærd og god videnskabelig praksis.
6. IHVR
- Efter at ofre dyr, måle lever vægten. Beregne IHVR: IHVR = PVBF/s. normalisere denne PVBF værdi til vægten af leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhængigt af den dyremodel og alvoren af leversygdom er graden af PHT og sværhedsgraden af portalen hypertensive syndrom forskellige (figur 7).
BDL-model forårsager biliær cirrhose på grund af kolestase. I overensstemmelse hermed, PP stiger over tid og en hyperdynamisk omsætning udvikler sig, som det ses af en stigning af HR og fald af kort. I cirrhotic dyr øge SMABF, PVBF og IHVR også konkurrenceloven til hepatisk og hæmodynamiske ændringer (figur 7A-F).
Derimod PPVL forårsager prehepatic, ikke-cirrhotic PHT, som er karakteriseret ved en umiddelbar stigning i PP og tilsvarende ændringer i systemisk Hæmodynamik (figur 7 g-jeg). Dog under tid-kursus portosystemisk soeskende udvikle som kan sænke PP.
De hæmodynamiske værdier af sham-opererede dyr forbliver på fysiologiske niveauer og ændrer ikke væsentligt over tid. Portalen trykket i sunde SO dyr er på maksimalt 5-6 mmHg (figur 7J-L).
Figur 1: Self-Made intubation enheder: (A) endotrakealtube. (B) Guide wire enhed (C) Intubation skrivebord. (D) rør tilsluttet guide wire enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: pre kirurgisk præparater: (A) Intubation af dyr. (B) Intramuscular og subkutan injektion for anæstesi. (C) fiksering af dyr på varme mat. (D) markedsføring og fastsættelse af rektal temperatur sonde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: puls (HR) og middel-arterielt tryk (kort): (A) hud indsnit. (B) forberedelsen af den femorale kar og nerve strukturer. (C-F) Dissektion af arteria femoralis. (G) distale sutur og fiksering - proksimale knude pre proksimale sutur. (H) forberedelse af den femorale kateter. (jeg) placering af den vaskulære mikro klemme. (J) Perforation af arteria femoralis med en bøje nål. (K) kateterisation af arteria femoralis. (L) åbning af den mikro klemme for vurdering af puls. (M) proksimale fiksering af kateter. (N) Distal fiksering af kateter. (O) måling af kort og HR. (P) der dækker den kirurgiske felt med gennemblødt lille gaze komprimere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: overlegne mesenteriallymfeknuderne arterielt blod Flow (SMABF): (En-C) Median laparotomi. (D) udgravning af coecum. (E-F) Udgravning af tarmen. (G) indpakning af tarmene i gennemblødt gaze komprimere. (Hansen-K) Forberedelse af splanknisk mesenterica arterie med stump kanyle kroge. (L, M) Fastgørelse af flow sonden. (N) anvendelsen af ultralyd gel på sonden flowsensoren. (O) korrekte 'ikke-prekære' placering af de af strømmen sonden. (P) måling af SMABF. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: portalen venøse blod Flow (PVBF): (A) optimeret dorsale se på portalen vene (B) dissektion af portalen vene fra mesenteriallymfeknuderne fedtvæv. (C) oprettelse af et væv tunnel for portåren flow sonde. (D, E) Fastgørelse af flow sonden til portalen vene. (F) anvendelsen af ultralyd gel på sonden flowsensoren. (G) korrekte 'ikke-prekære' placering af flow sonden. (H) måling af PVBF. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Portal pres (PP): (A) forberedelse af kateter. (B) forberedelsen af tarmene. (C) optimeret se på de vigtigste mesenteriallymfeknuderne venøs Vaskulaturen. (D) Perforation af visceralt bughinden og forfremmelse af grenen kateter tættere på egnet kar. (E) kateterisation af ileocolic vene i krydset vinkel mellem de vigtigste gren og en side-filial. (F) fremme af kateter spidsen ind i portal vene tættere til leveren hilum. (G, H) Måling af s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: repræsentant resultater: Tidsforløb (A) PP, (B) kort og (C) HR i BDL rotter. I overensstemmelse hermed, der observeres ændringer i (D) SMABF, (E) PVBF og (F) IHVR. I PPVL, er hæmodynamiske ændringer (G) PP, (H) kort og (jeg) HR mest udtalt i de tidlige dage efter operationen. I drives sund sham-(så) dyr, (J) PP, (K) kort og (L) HR ligge inden for fysiologiske værdier og ændrer ikke over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PP er parameteren Hovedresultatet for evaluering af portalen hypertensive syndrom og afspejler graden af underliggende skrumpelever. Både matrix deposition (dvs., fibrose) og sinusformet vasokonstriktion (skyldes øget hepatisk udtryk for vasoconstrictors og nedsat lydhørhed over for vasodilatorer) forårsage øget IHVR. Betydningen af PP og dens indvirkning på kronisk leversygdom har været vist i flere prækliniske11,12,13,14 og kliniske undersøgelser15,16, 17 , 18. derfor hos cirrhotic patienter, PP er et parameter, hårde udfald, og sin reduktion er anbefalet af behandling retningslinjer19,20 og en vigtigste forskning mål af nuværende hepatologi. Omfattende dyremodeller er nødvendige for at karakterisere og oversætte16,21 nye behandlingsmuligheder af PHT22. Denne protokol præsenterer den metode, der er behov for en detaljeret hæmodynamiske karakterisering, herunder vurdering af portalen pres, hyperdynamisk omsætning, splanknisk vasodilatation og intrahepatisk modstand. For at opnå en repræsentant og fuld hæmodynamiske datasæt fra gnavere modeller, er erfaring og uddannelse af operatoren udfører af allerstørste betydning.
Forebyggelse og bekæmpelse af alvorlige blødninger er især vigtige færdigheder. Stumpt og præcise præparater af de vaskulære dele af interesse er kritisk for at undgå cannulation fejl og alvorlige blødninger. Betydelig blodtab indvirker på Hæmodynamik og er til hinder for nøjagtige målinger af PP eller kan endda resultere i død for laboratory animal. Dokument blødninger, der har fundet sted under målingerne i protokollerne og karakterisere sværhedsgraden og placeringen af blødning.
Af note, ved hjælp af perivascular ultralyd flow sonder for at vurdere blodgennemstrømning genererer kun en tilnærmelse og kan blive udsat for læsning fejl, på grund af forskellige fartøj størrelser og forkert sonde justering. En anden teknik til at måle blodgennemstrømning og især blod-flow distribution (herunder beregning af portosystemisk rangering) er farvet microsphere teknik23. Men hele organer skal høstes, opløst og analyseret, og dette udelader mulighed for at udføre histologiske eller udtryk analyse. Derfor, ultralyd teknik støtter principperne om de '3 R'er' i dyreforsøg (begrænse, forfine og erstatte) af Russell og Burch24. Derudover er flow sonder velegnet til at overvåge splanknisk blodgennemstrømningen i realtid og parallelt med andre hæmodynamiske parametre, mens den farvede microsphere teknik kræver integration orgel (mesenteriallymfeknuderne blod) flow over tid. Derudover farvede mikrokugler, som normalt har en diameter på 15 µm, kræver en normalfordeling af mikro-skibe med en diameter < 15 µm i de respektive organer for at undgå at blive fanget og ubevægelige, som måske ikke være tilfældet i cirrhotic lever.
Den største begrænsning af denne metode er behovet for en tilstand af bevidstløshed og anæstesi under hæmodynamiske karakterisering af PHT syndrom hos dyr. Den mest almindelige og udbredte injektion anæstesi ketamin/xylazin kræver ofte redosing efter 30-45 min til at opnå en nødvendig dybde af anæstesi25,26; Dette tilføjer tidspres, især hvis fejlfinding er nødvendig. Ved hjælp af inhalation anæstesi indebærer mange fordele, men særligt udstyr er påkrævet, og sikkerhed forordninger vedrører flygtige anæstetika skal følges. Dybde af anæstesi kan tilpasses hurtigt uden at forstyrre kirurgi procedurer ved at justere anæstesi koncentration. Den endotrakealtube sikrer airways, især efter aktivering af frelsen af ketamin og ventilation sikrer tilstrækkelig iltning og ventilation af dyret til at sænke risikoen for anæstesi-induceret død27. Mens ketamin/xylazin er stadig i vid udstrækning medfører anvendes, lav-dosis isofluran anæstesi ingen væsentlige ændringer i hæmodynamiske eller hjerte-kar-parametre i rotter28,29.
Lokal erfaring og forordninger giver opsatte anbefalinger og bedste praksis for anæstesi og forskerne skal løbende overveje typen af anæstesi anvendes til at udføre disse hæmodynamiske vurderinger30. Fremtidige eksperimenter kan bruge telemetri med indopereret trådløse Tryktransducere, der kan overvinde de nuværende begrænsninger relateret til generel anæstesi og tillade hæmodynamiske karakterisering af bevidste dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker de dyrlæger, sygeplejersker og animalske ihændehavere på Center for biomedicinsk forskning for deres fortsatte støtte under vores forskningsprojekter. Forfatterne anerkender den vigtige input af alle anmeldere af denne protokol. Nogle af forskningen blev finansieret af "Unge Science Award" af den østrigske samfund for gastroenterologi og hepatologi (ÖGGH) til PS og "Skoda Award" af den østrigske Society of Internal Medicine at TR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| LabChart 7 Pro software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Software |
| ML870 PowerLab 8/30 | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Electronic multichannel recorder |
| MLT0380/D | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure) |
| ML112 Quad Bridge Amplifier | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Bridge amplifier |
| TS420 | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | - | Flowmeter module |
| Biological Research Apparatus 7025 | UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy | - | Ventilator |
| Vapor 2000 | Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany | - | Isofluran Vaporizer |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA1PRB | Ultrasonic flow probe (1mm) |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA2PSB | Ultrasonic flow probe (2mm) |
| 1st for intubation & 2nd for clean skin incisions | - | - | Mayo scissor [x2] |
| Metzenbaum scissor | - | - | - |
| Cuticle scissor | - | - | - |
| e.g. Adson Brown tissue forceps | - | - | Tissue Forceps |
| High precision 45° angle broad point forceps [x2] | - | - | - |
| Hemostat [x4] | - | - | - |
| e.g. Mikulicz peritoneal clamp | - | - | Curved clamp |
| e.g. Dieffenbach clamp | - | - | Micro clamp |
| e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm, | - | - | Micro metal spatula |
| for transbuccal suture at intubation | - | - | Needle holder |
| Scalpel grip | - | - | - |
| selfmade | - | - | Intubation desk |
| blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow | - | - | Blunt steel wire |
| modified arterial line 20G with Flowstich | Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK | #682245 | Arterial line |
| Heating pad | - | - | - |
| Rectal temerature probe | - | - | - |
| Saline heater | - | - | - |
| Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat) | - | - | - |
| Inductionbox for inhalation anesthesia | - | - | - |
| Scale (able to measure mg) | - | - | - |
| Hair clipper | - | - | - |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden | #393230 | Peripheral venous catheter (14G) |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, | Smiths Medical International Ltd., Kent, UK | #800/100/200 | Catheter tube (PE-50) |
| e.g. Omnifix-F Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #9161406V | Syringe 1mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606051V | Syringe 5mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606205V | Syringe 20mL |
| e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304622 | Cannula (18G) |
| e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #300800 | Cannula (23G) |
| e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304000 | Cannula (30G) |
| e.g. Leukoplast S | BSN medical GmbH, Hamburg, Germany | #47619-00 | Adhesive tape |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10972 | Gauze compress (small) |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10961 | Gauze compress (big) |
| Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 | SMI AG, St. Vith, Belgium | #2021-04 | Suture (Silk 4/0, EP 1.5) |
| e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany | #EH7552 | Transbuccal suture |
| e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) | Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany | #967936 | Cotton buds |
| e.g. Vue Ultrasoundgel | Optimum Medical Limited, UK | #1157 | Ultrasound gel |
| e.g. Glubran 2 | Gem srl, Viareggio, Italy | #G-NB2-50 | Tissue glue |
| e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel | Swann-Morton, England, B.S. | #202 | Scalpel Knife |
| Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) | Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria | - | Heparin |
| Florane | Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK | - | Isoflurane |
| OeloVital (5g) | Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria | - | Eye gel |
| Ketasol | aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany | - | Ketamine |
| Rompun | Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria | - | Xylazine |
| Xylocain 10% Pumpspray | AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria | - | Lidocaine pump spray |
| Dipidolor | Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria | - | Piritramide |
| NaCl 0.9% Fresenius, 1L | Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria | #13LIP132 | Physiological saline solution |
References
- Ripoll, C., et al. Hepatic venous pressure gradient predicts clinical decompensation in patients with compensated cirrhosis. Gastroenterology. 133 (2), 481-488 (2007).
- Bosch, J., Groszmann, R. J., Shah, V. H. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: How changes in paradigm are leading to successful new treatments. J Hepatol. 62, S121-S130 (2015).
- Blachier, M., Leleu, H., Peck-Radosavljevic, M., Valla, D. C., Roudot-Thoraval, F. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data. J Hepatol. 58 (3), 593-608 (2013).
- Colle, I., Geerts, A. M., Van Steenkiste, C., Van Vlierberghe, H. Hemodynamic Changes in Splanchnic Blood Vessels in Portal Hypertension. Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 699-713 (2008).
- Laleman, W., Van Landeghem, L., Wilmer, A., Fevery, J., Nevens, F. Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver International. 25 (6), 1079-1090 (2005).
- Franchis, R. d Updating Consensus in Portal Hypertension: Report of the Baveno III Consensus Workshop on definitions, methodology and therapeutic strategies in portal hypertension. Journal of Hepatology. 33 (5), 846-852 (2000).
- Zardi, E. M., Di Matteo, F. M., Pacella, C. M., Sanyal, A. J. Invasive and non-invasive techniques for detecting portal hypertension and predicting variceral bleeding in cirrhosis: a review. Annals of medicine. 46 (1), 8-17 (2014).
- Kumar, A., Sharma, P., Sarin, S. K. Hepatic venous pressure gradient measurement: time to learn. Indian J Gastroenterol. 27 (2), 74-80 (2008).
- Tsochatzis, E. A., Bosch, J., Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet. 383 (9930), 1749-1761 (2014).
- Abraldes, J. G., Pasarín, M., García-Pagán, J. C. Animal models of portal hypertension. World Journal of Gastroenterology : WJG. 12 (41), 6577-6584 (2006).
- Reiberger, T., et al. Sorafenib attenuates the portal hypertensive syndrome in partial portal vein ligated rats. Journal of Hepatology. 51 (5), 865-873 (2009).
- Schwabl, P., et al. Pioglitazone decreases portosystemic shunting by modulating inflammation and angiogenesis in cirrhotic and non-cirrhotic portal hypertensive rats. Journal of Hepatology. 60 (6), 1135-1142 (2014).
- Reiberger, T., et al. Nebivolol treatment increases splanchnic blood flow and portal pressure in cirrhotic rats via modulation of nitric oxide signalling. Liver International. 33 (4), 561-568 (2013).
- Schwabl, P., et al. The FXR agonist PX20606 ameliorates portal hypertension by targeting vascular remodelling and sinusoidal dysfunction. Journal of Hepatology. 66 (4), 724-733 (2017).
- Mandorfer, M., et al. Sustained virologic response to interferon-free therapies ameliorates HCV-induced portal hypertension. J Hepatol. 65 (4), 692-699 (2016).
- Schwabl, P., et al. Interferon-free regimens improve portal hypertension and histological necroinflammation in HIV/HCV patients with advanced liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 45 (1), 139-149 (2017).
- Reiberger, T., Mandorfer, M. Beta adrenergic blockade and decompensated cirrhosis. Journal of Hepatology. 66 (4), 849-859 (2017).
- Reiberger, T., et al. Carvedilol for primary prophylaxis of variceal bleeding in cirrhotic patients with haemodynamic non-response to propranolol. Gut. 62 (11), 1634-1641 (2013).
- Reiberger, T., et al. Austrian consensus guidelines on the management and treatment of portal hypertension (Billroth III). Wiener klinische Wochenschrift. 129 (3), 135-158 (2017).
- de Franchis, R. Expanding consensus in portal hypertension. Journal of Hepatology. 63 (3), 743-752 (2015).
- Pinter, M., et al. The effects of sorafenib on the portal hypertensive syndrome in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma - a pilot study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 35 (1), 83-91 (2012).
- Schwabl, P., Laleman, W. Novel treatment options for portal hypertension. Gastroenterol Rep (Oxf). 5 (2), 90-103 (2017).
- Klein, S., Schierwagen, R., Uschner, F., Trebicka, J. Mouse and Rat Models of Induction of Hepatic Fibrosis and Assessment of Portal Hypertension. , (2017).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Langhans, W., Myrtha, A., Riediger, T., Lutz, T. A. Routine animal use procedures. , Institute of Veterinary Physiology, University of Zurich, Physiology and Behavior Laboratory, Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich. (2016).
- Animal Care and Use Program. Rat and Mouse anesthesia and analgesia: Formulary and General Drug Information. , The University of British Columbia. (2016).
- Davis, J. A. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Veterinary Research. 10 (1), 198 (2014).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
- Becker, K., et al. Statement on anesthesia methodologies: Recommondations on anaesthesia methodologies for animal experimentation in rodents and rabbits. , GV-SOLAS - German veterinary association for animal welfare. (2016).
