Summary
이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
정상적인 성인 심장 중 심장 mesenchymal stromal 세포는 풍부한 인구를 대표 하는 여러 다른 세포 유형, 구성 됩니다. 이러한 셀의 심장 질병에 그들의 참여의 가능성을 제공 하 고, 또한, 생물 학적 메커니즘을 조사 하는 유용한 1 차 셀 모델을 제공 합니다.
여기, arrhythmogenic 심근 환자의 bioptic 샘플에서 C-MSC의 격리에 대 한 방법을 설명 합니다. Endomyocardial 생 검 샘플링 전기 해부학 매핑에서 시각 흉터에 인접 한 오른쪽 심 실 지역에서 가이드입니다. 콜라와 C-MSC 성장 수 있도록 문화 매체에서 플라스틱 접시에 그들의 도금 biopsies의 소화 설명 되어 있습니다. 몇 구절에 대 한 문화에서 고립 된 셀을 확장할 수 있습니다. 확인 하 고 그들의 엽 형, 면역 phenotypical 특성의 설명 제공 됩니다. C-MSC adipocytes, chondrocytes, osteoblasts 같은 여러 세포 유형으로 분화 할 수 있다: 맥락에서 ACM의, 환자의 마음에 체형 예금, C-MSC의 adipogenic 차별화에 대 한 프로토콜 특징 및 지질 방울 축적의 특성을 설명 합니다.
Introduction
중간 엽 기질 세포 (MSC)는 많은 조직1에 중요 한 지원 기능을 가진 성인 세포 이다. 골, MSC의 역사적 소스 하지만 그들은 태 반, 지방 조직, 탯 줄 혈액, 간, 그리고 심장1,2를 포함 하 여 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다.
2006 년에, 국제 사회에 대 한 세포 치료 (ISCT) 지정, 처음으로 인간 MSC3를 정의 하는 최소한의 조건을. 특히, MSC 플라스틱을 준수 하는 능력을가지고 있어야 합니다. 그들은 특정 표면 항 원 표현:는 양성 CD44, CD105, CD29, CD90 엽 마커 및 부정적 CD14, CD45, CD34, CD31 조 혈과 내 피 마커 특징 MSC. HLA-DR의 부족 표현으로 인해 MSC는 alloreactivity를 실행할 수 수 없습니다. 또한, 그들은 adipogenic, chondrocyte, 및 osteoblast 계보1,3으로 차별화 하는 잠재력을 가진 multipotent 셀.
심장 세포 구성에 초점을 맞추고, 심장 중간 엽 기질 세포 (C-MSC) 정상적인 성인 심장4,5에서 풍부한 있습니다. 그들은 모두 정상적인 심장 기능 및 병 적인 조건에 중요 한 역할. 순수, 심근의 구조 및 기능적 무결성을 지 원하는 microenvironment를 제공 하는 C-MSC, 심장 질환에서 그들은 상처 치유와6을 개장 하는 거리에 참여 하는 심장 부상에 대 한 응답에서 활성화 됩니다 ,7.
최근, arrhythmogenic 심근 (ACM) 지방 대체에서 C-MSC의 참여 시연된8되었습니다. 특히, ACM 주로 우 심 실9에서 주로 심근 fibro 지방산 보충 하는 desmosomal 유전자에 있는 돌연변이 의해 발생 하는 유전 질환 이다. Endocardium, epicardium에서 연장 하는이 대체 비 전도성 기판 elicits 진보적인 심장 마비를 악화, 심한 경우, 갑작스런 죽음에 지도할 수 있는 심 실 부정맥을 만듭니다. Sommariva 외. 시연 사전 adipocytes의 간 엽 기원 ACM 환자의 explanted 심장 섹션에 존재. 또한, C-MSC ACM 마음 익스프레스 desmosomal 유전자의 endomyocardial 생 검에서 격리 하 고 따라서 그들의 변이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 특히, 조건 하에서 adipogenic, ACM C-MSC 제어 마음에서 그 보다 더 많은 지질 축적. 이 증거 C MSC와 질병 병 인에 있는 활동적인 역할 ACM 공부를 유효한 셀 모델을 나타내는 결론에 이르게.
이런이 맥락에서 또는 다른 심장 질환 심장 생은 표시에서 미래 연구를 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜 endomyocardial 조직, 그들의 확장, 그들의 면역 phenotypical의 작은 파편에서 C-MSC의 격리에 대 한 제시 특성, 그리고 adipogenic 차별화입니다.
Protocol
헬싱키의 선언 준수이 접근 하 고 오른쪽 심 실 샘플의 컬렉션 (07/06/2012) "센트 Cardiologico Monzino IRCCS" 윤리 위원회에 의해 승인.
1입니다. 솔루션
- C-MSC 문화에 대 한 TMES 매체와 Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM), 20% 보충 하 게 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 10000 U/mL 페니실린, 10000 µ g/mL 스, 그리고 0.02 M L-글루타민. TMES 매체 0.22 μ m 살 균 필터 단위를 사용 하 여 필터링 및 4 ° c.에 저장
- 콜라 솔루션을 준비 하려면 콜라 NB4 믹스 3 mg/mL의 농도로 최종 솔루션을 얻기 위해 IMDM 매체에 resuspend. 분말, 그리고 콜라 솔루션 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링을 부드럽게 소용돌이. Aliquot 1 mL 2 mL 무 균 튜브에-20 ° c까지 사용 하기 위해 필요한 저장소 볼륨.
- 10 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (0.5 M의 농도에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 미리 희석 및 사용까지-20 ° C에서 보관), (사전 희석 1 µ M 날린 보충 T. ADIPO 매체를 준비, IMDM 매체 adipogenic 매체를 100 살 균 10 m m m m 및 더 희석에 DMSO에 증류수와 사용까지-20 ° C에서 보관) 및 0.1 m m indomethacin (0.5 M의 농도에서 DMSO에 미리 희석 및 사용까지-20 ° C에서 보관). T. ADIPO 매체 0.22 μ m 살 균 필터 단위를 사용 하 여 필터링 및 4 ° c.에 저장
- 세척 버퍼 인산 염 버퍼 염 0.0067 M 포4 (PBS), ethylenediamine 테 트 라 아세트산 (EDTA) 구성 준비 5 밀리미터, 및 5% 소 혈 청 알 부 민, 그리고 4 ° c.에 게
- 소 프로 파 놀 60%에서에서 1% 오로 분말을 용 해, 2 시간, 혼합 하 고 침전을 제거 하는 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 필터링 하 여 기름 빨간 O (오로) 작업 솔루션을 준비 합니다. 실 온 (RT)에서 작업 솔루션을 저장 합니다.
2입니다. 심장 중간 엽 기질 세포의 고립
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심장 생 수집 및 처리
참고: 시작 하기 전에, 콜라 솔루션 및 준비 TMES 매체를가지고 있는지 확인.- 넣어 ACM endomyocardial 생 검 (보통 약 5 mg의 조직) 무 균 튜브에 TMES 채워지고 실험실에 수송.
참고: ACM biopsies 이전 보고서10에 따라 전기 생리학 수술 실에서 수집 됩니다. 간단히, 전기 해부학 매핑 및 우 심 실에서 intracardiac 심장 초음파의 통합 ( 비디오 1참조)을 사용 endomyocardial 생 검 ( 비디오 2, 참조 fluoroscopy)의 테두리 영역에 대응에는 질병 심근입니다. 건강 한 제어 (HC) 샘플 조직 바이오-은행, 죽음 (우발적인 죽음, 건강 한 과목)의 24 시간 안에 시체 기증자의 오른쪽 심 실 무료 벽에서 가져온에 의해 제공 됩니다. 전송 중 및 해 부 이전, 저장 생 검 TMES에 4 ° c.에 생 검 컬렉션 및 조직 처리 (최대 24 시간) 사이의 시간을 제한 합니다. - 설정 생물 안전 캐비닛 효소 소화까지 절차를 수행 하기 위해 필요한 솔루션.
- 후드 아래 살 균 제를 넣고 온도 상승 200-250 ° c.까지 악기 사용 하기 전에 15 분 설정
- 가 위를 소독 하 고 핀셋 10 s. 확인 확실히 소독된 계기는 사용 하기 전에 차가운. 일회용 멸 균 scalpels 준비.
- 살 균 후드에 생 검 튜브를 놓습니다. 튜브를 열고 생 검 살 균 격판덮개로 전송 합니다.
- 우 심 생 멸 균 PBS의 3 mL로 두 번 씻는 다. 당신이 원하는 경우에 현미경에서 생 검의 사진을 찍을.
- 우 심 실 생 검, 콜라 솔루션의 1 mL를 포함 하는 메 마른 2 mL 튜브에 멸 균 핀셋을 사용 하 여 전송 합니다.
- 살 균가 위 샘플을 0.5-1 m m3 조각으로 잘라.
- 1.5 h 연속 회전 동요에서 37 ° C에서 품 어.
- 실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 소화 용액을 원심
- 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 세척 살 균 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
- 실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기
- 제거는 상쾌한 고 TMES 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 얻은 정지 처리 살 균 60 m m 조직 문화 접시에 접시와 3 mL의 최종 볼륨을 TMES 매체를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
참고: 매체의 높은 볼륨 소화 생 조각의 정확한 접착을 방지할 수 있습니다. - 24 시간 후 매체 비 부착 한 세포와 파편 제거를 삭제 합니다.
참고: 단일 해리 중간 엽 세포 수 플라스틱 표면에 연결 하 고 일으키 다 클론; 또한, 소화 되지 않은 작은 생 검 조각 플라스틱 접시를 연결 하 고 셀 돋 아 허용 수 있습니다. - 살 균 PBS의 5 mL로 두 번 접시를 세척 하 고 신선한 TMES 매체의 3 개 mL를 추가.
- 세포가 80% 합칠 때까지 주 번 3 TMES 매체를 교체 합니다.
참고: 연결 된 셀의 수에는 소화의 효율 및 품질, 조직의 금액에 따라 달라 집니다.
- 넣어 ACM endomyocardial 생 검 (보통 약 5 mg의 조직) 무 균 튜브에 TMES 채워지고 실험실에 수송.
3. 셀 확장
참고: 시작 하기 전에 TMES 중간 준비 해야 합니다.
- 세포가 80 %confluent, 전송 하는 경우 새로운 살 균 60 m m 조직 문화에 소화 작은 bioptic 샘플 접시, 처리 하 고 신선한 TMES 매체의 3 개 mL를 추가.
참고: Bioptic 샘플 C-MSC 격리 추가 대 한 다시 사용 수 있습니다. 그것은 고립 된 세포 수가 될 때까지이 절차를 반복 수 있습니다. - 워시 살 균 PBS의 3 mL로 두 번 연결 된 셀. 트립 신-EDTA 솔루션 (0.5 mL 60 mm 접시에 대 한), 추가 하 고 셀 분리 수 있도록 3-5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 셀은 접시의 표면에서 분리 때 하는 트립 신을 비활성화 하 고 새로운 50 mL 무 균 튜브에 세포를 수집 살 균 FBS의 0.5 mL를 추가 합니다.
- 접시 같은 튜브를 나머지 셀을 추가할 살 균 PBS의 5 mL로 두 번 씻는 다.
- 실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심
- 제거는 상쾌한 고 TMES 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 챔버를 계산 하는 셀에 셀 서 스 펜 션의 10 µ L을 로드 합니다.
참고: 셀은 너무 집중, PBS에서 초기 정지 1시 10분 희석 하 고 챔버를 계산 하는 셀에 희석 셀 10 µ L를 로드 하십시오. - 현미경에서 셀 3 큰 사각에 및 그들의 측면의 두 라인에 하 고 셀의 평균 수를 계산 합니다.
참고: 셀/mL의 수를, 계산된 셀의 평균을 곱합니다 104, 챔버를 계산 하는 셀의 희석 비율. 셀 더 희석 된, 경우 희석 비율에 대 한 증식. 씨앗을 셀 수와 세포 농도 (셀/mL의 수) 사이의 비율 초기 정지 (3.9 점) 다음 단계에 대 한 도금의 (mL)에 있는 볼륨에 해당 합니다. - 5000-10000 셀/c m2 의 최종 농도에 처리 살 균 100 m m 조직 문화 접시에 물의 resuspension 플레이트와 8 mL의 최종 볼륨을 TMES 매체를 추가 합니다. 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
참고: 세포는 70-80% 합칠 때 셀 확장 절차를 반복 합니다. 모든 통로 (P)에 셀과 접시 나머지 금액의 일부를 cryopreserve 하는 것이 좋습니다. P3 또는 P4 셀을 확장 하 고 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석 (제 4) 및 adipogenic 차별화 (5 절)에 대 한 사용. - 실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심 분리 후 cryopreservation에 대 한
- 수 셀으로 (단계 3.7-3.8)을 설명 하 고 살 균 FBS의 900 µ L에 1 x 106 셀 resuspend. 메 마른 곳을 알아내는-유리병에 전송 및 살 균 DMSO와 섞어 100 µ L를 추가.
- 신속 하 게 적어도 2 일 동안-80 ° C에서 냉동 컨테이너로 cryo-튜브를 저장 하 고 액체 질소에 튜브를 전송.
4. Cytometry에 의해 심장 중간 엽 기질 세포의 특성
참고: 시작 하기 전에, 셀 분리 시, 세척 버퍼, 그리고 준비 하는 특정 항 체를가지고 있는지 확인 합니다.
- 휴대폰 번호에 도달 하면 적어도 3 x 106 (3.7-3.8에 설명 된 대로 셀 개수) 살 균 PBS의 10 mL로 두 번 100 mm 접시 세척.
- 셀 분리 시 약의 5 mL을 추가 하 고 셀 분리 수 있도록 RT에서 7-10 분을 기다립니다.
- 셀은 접시의 표면에서 분리 때 살 균 세척 버퍼의 15 mL를 추가 하 고 새로운 50 mL 무 균 튜브에 정지를 수집 합니다.
- 두 번 버퍼를 세척의 10 mL와 함께 접시를 세척 하 고 나머지 셀 같은 관을 추가.
- RT에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심 및 버퍼 세척의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 단계로 설명 (3.7-3.8), 셀을 계산 하 고 새로운 무 균 튜브에 3 x 106 셀을 전송 1.5 mL의 최종 볼륨을 세척 버퍼를 추가.
참고: 총 셀 번호와 세척 버퍼의 총 볼륨 선택된 마커 분석 (각 FACS 폴리스 티 렌 튜브에 대 한 100 µ L에서 3 x 105 셀)에 대 한 사용의 수에 따라 달라 집니다. - 100 µ L 12 다른 FACS 폴리스 티 렌 튜브에 세포 현 탁 액의 고 농도 제품 데이터 시트에 표시 된에서 특정 항 체를 추가.
참고: C-MSC 특성에 사용 되는 항 체 있습니다 CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14, 및 HLA-DR (표 1). 그것은 resuspended 세포 isotype 컨트롤 신호의 특이성을 확인을 물 들일의 100 µ L의 구성 컨트롤 샘플을 준비 하는 것이 중요. - 어둠 속에서 15 분 샘플을 품 어.
- 반응을 중지를 각 튜브를 살 균 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- 실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 세척 버퍼의 250 µ L에 펠 릿을 resuspend.
- Cytometry와 C-MSC 특성화를 진행 합니다.
5. Adipogenic 심장 중간 엽 기질 세포의 분화
참고: 시작 하기 전에, T. ADIPO 매체와 오로 작업 솔루션을 준비 해야 합니다.
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T. ADIPO 매체 문화
- 분리 하 고 셀 섹션 3에에서 설명 된 대로.
- 살 균 6 잘 조직 문화의 각 음에 접시 3 x 105 셀 T. ADIPO 매체의 2 mL에 접시를 취급.
- C-MSC T. ADIPO 매체 72 h 또는 1 주, 보통 2-3 일 마다 변경 차별화 하자.
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기름 빨간 O 얼룩
참고: 사용 오일 레드 O (오로) C-MSC에서 지질 축적을 테스트 하려면 얼룩.- 6 잘 조직 문화 plateunder 연기 후드를 놓습니다.
- Adipogenic 매체를 제거 하 고 세척 2 mL의 PBS로 두 번 셀.
- 각 커버 4 %paraformaldehyde (PFA)의 충분 한 볼륨 추가 잘. 실시간에서 5 분에 대 한 셀을 수정
- PFA 무시 하 고 PBS의 2 mL로 두 번 셀을 씻어.
- 고정된 셀 오로 충분 한 볼륨을 사용 하 여 각을 커버 하는 RT에 1 시간에 대 한 작업 솔루션을 품 어 잘.
참고: 오로 작업 솔루션의 증발을 피하기 위해 오로 부 화 하는 동안 연기 후드 6 잘 조직 배양 플레이트를 보관 하지 마십시오. - 모든 오로 작업 솔루션을 제거 하 고 씻어 2 mL PBS 3-5 번까지 접시 완전히 청소 된다; 세척을 삭제 합니다. PBS 사용은 분명 하다 고 표시 되지 않으면, 현미경, 불특정 세포에서 얼룩이 지는 세척을 중지 합니다.
- 거꾸로 조직 문화 단계 대조 현미경을 사용 하 여 각 잘 20 배 확대에 20 이미지를 캡처하십시오.
- 셀 오로 누적 계량을 이미지 프로세싱 프로그램 그림을 엽니다.
- 255-레드 채널에서 휘도을 측정 하기 위해 "채널 분할" 기능을 통해 다른 색상 채널을 구분 합니다.
- 핵을 계산 하 여 각 사진에 대 한 셀의 개수를 계산. 휴대폰 번호에 오로 신호 강도 정상화.
- 동일한 샘플의 각 그림에 대 한 얻은 결과의 평균을 계산 합니다.
Representative Results
심장 stromal 세포 격리: Endomyocardial 생 검 절차에서 C-MSC 격리는 그림 1에 요약 됩니다.
심장 stromal 세포 엽 특성: 세포 치료 (ISCT)에 대 한 국제 사회에 의해 설립, multipotent mesenchymal stromal 세포를 정의 하기 위한 최소한의 기준을 자신의 면역 phenotypic 특성3포함 되어 있습니다. 특히, 그들의 엽 계보를 확인 하려면 셀 적절 한 FITC/PE/APC 활용 된 항 체와 알을 품 이며 cytometry에 의해 분석. C-MSC 특성에 사용 되는 항 체의 모든 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 생 검에서 얻은 C-MSC는 특정 엽 표면 항 CD29, CD44와 CD105에 대 한 긍정적 이다. 11이전 보고 CD90 긍정적인 세포의 비율 변수입니다. 내 피 (CD31, CD34), monocyte/대 식 세포 (CD14), 조 혈 (CD45) 마커, 및 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (HLA-DR) 되지 않습니다 (그림 2)를 표현.
심장 mesenchymal stromal 세포 adipogenic 차별화: 그들의 adipogenic 차별화를, C-MSC ACM 및 HC에 의해 영향을 받는 환자에서 얻은 T. ADIPO 매체에 경작 될 필요가 (솔루션 섹션 참조). 셀 교체 매체 일주일에 두 번 72 h 또는 1 주에 대 한 문화에서 유지 됩니다.
세포내 지질 방울의 축적은 오로 얼룩 (그림 3)에 의해 입증 됩니다. ACM 및 HC에서 얻은 세포 사이 능력 뿐만 아니라, 차별화의 정도에 차이 관찰할 수 있습니다. 대표 이미지 에서처럼 ACM C-MSC 문화 adipogenic 매체 (그림 3)에서 72 h 후 더 많은 지질 방울 HC C-MSC 보다 축적. 이러한 차이 셀 더 긴 기간 (1 주) (그림 3)에 대 한 adipogenic 차별화 조건에 노출 되 면 또한 유지 됩니다.
비디오 1: Electroanatomical 지도 intracardiac 심장 초음파의 통합. Endocardial 유 니 폴라 electroanatomical endomyocardial 생 검 (낮은 패널)를 겪 습 환자에서 우 심 실 (왼쪽된 앞쪽 오블리크 및 오른쪽 앞쪽 간접 보기)의 지도. 낮은 전압 (빨강/녹색)의 제한 된 영역 꼭대기에서 볼 수 있습니다. Endomyocardial bioptic 샘플 (태그 원)는 질병 심근을 interventricular 심장 서신에 수집 됩니다. 실시간 intracardiac 심장 초음파 검사 대상 지역 (위 패널)에서 bioptome의 정확한 위치를 수 있습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2: 오른쪽 앞쪽에 경사 보기에서 Fluoroscopy 비디오. bioptome 장기 deflectable 덮개를 통해 삽입 하 고는 심 실에 고급. 심근과 bioptome 접촉의 주의 깊은 검사 후 문 턱은 열리고 샘플을 수집 하도록 단단히 폐쇄. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 1: 절차 초안. Endomyocardial bioptic 샘플 bioptome 카 테 터, 작은 협공 모양의 절단 장비를 사용 하 여 수집 됩니다. 얻은 생의 무게는 약 5 m g (A). Endomyocardial bioptic 샘플은 무 균가 위 (B), 0.5-1 m m3 조각으로 다진 고 콜라 솔루션 추가 됩니다. 샘플은 소화 (C)의 1.5 h에 대 한 회전 플랫폼 믹서에 37 ° C 배양 기에 배치 됩니다. 소화 솔루션 centrifuged 이며 플라스틱 접시 (D)에 TMES에 도금. C-MSC 그들의 플라스틱 준수 속성 단일 셀 또는 클론, 또는 작은 소화 되지 않은 bioptic 조각 (E)에서 돋 아에서 얻을 수 있습니다. C-MSC cytometry (F) 다음 특징입니다. C-MSC는 adipogenic 매체에 도금 고 지질 방울 축적 기름 빨간 O 얼룩 (G)에 의해 테스트 됩니다. 눈금 막대 표시 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: C-MSC의 대표적인 cyto-fluorimetric 프로필. 각 히스토그램 표시 된 채널에서 형광의 강도 대 셀 수를 보여 주는 (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). 각 그래프 isotype 제어 (화이트)와 샘플 특정 셀 활용 된 표면 마커 항 체 (레드)이 표시 됩니다. C-MSC는 엽 표면 항 원 CD29, CD44, CD105와, 부분적으로, CD90, 긍정적인 CD31, CD34, CD14, CD45, 및 HLA-박사를 표현 하지 않는 반면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Adipogenic C-MSC의 차별화. ACM 및 HC C-MSC, 72 h 및 1 주, adipogenic 매체에서 경작의 대표 이미지 오로 물 들일 (왼쪽된 사진; n = 3). 오른쪽 그래프에서 255-레드 채널 얼룩의 광도의 정량화 보고: 강도 임의의 단위 (거리)에 표시 됩니다. ACM C-MSC 컨트롤 보다 더 많은 지질 방울 축적. 스튜던트 T-검정 사용 되었다 *: p < 0.05. 눈금 막대 표시 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
MSC와 C-MSC: MSC multipotent 셀 다른 성인 조직, 골 수, 지방 조직, 연골, 뇌, 피부, 태아 부속, 및 심장12등의 실질 부분에 있습니다. 다른 연구 분리 하 고 기본 및 변환 연구12,13의 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 특성 수행 되었습니다.
건강 한 조건에서 MSC는 무부하, 낮은 속도14에서 자체 갱신. 이후 그들은 환경 병 적인 변화에 노출 되는, 그들은 직접 transdifferentiation, 매트릭스 증 착, 또는 paracrine 효과14를 통해 육성 조직 리 모델링 반응.
심장 MSC (C-MSC) 심장4의 큰 비 myocyte 세포 인구를 나타냅니다. 그들은 epicardium에서 발생 하 고 상피-엽 전환15의 과정을 겪고 심근으로 마이그레이션할. 그들은 심장 구조, 생리와 cardiomyocytes와 세포 외 기질 항상성7,16상호 작용을 통해 병 적인 상태에서의 기계적 / 전기적 무결성에 기여할. 그러나, 광범위 한 범위의 C-MSC 기능은 아직도 완전히 이해 된다. 생리와 병 적인 조건에서 둘 다 생체 외에서 학문에 의해 촉진 될 수 그들의 역할의 더 깊은 지식을 그들의 격리 후 수행 합니다.
C-MSC는 인간의 마음, 심 방 부속 기2,17 등 우 심 실18의 다른 지구에서 얻은 되었습니다.
최근, C-MSC에서 인간의 오른쪽 심 실 endomyocardial bioptic 샘플을 되었습니다 가져올8, 소스 조직으로 3-5 밀리 그램으로 작은 것을 보여주는.
가능한 응용 프로그램: 이 원고에 설명 된 방법은 매우 작은 심장 표본에서 소화와 플라스틱 준수에 대 한 선택과 같은 몇 가지 간단한 구절에 포함 된 셀을 취득 수 있습니다.
C-MSC 이후 그들은 증폭 하 고 생체 외에서유지 하기 쉬운 엽 혈통 (endothelium, osteocytes, adipocytes)의 세포로 분화 할 수 셀 모델을 여겨질 수 있다. 또한, 환자에서 직접 셀을 얻기의 가능성 맞춤/정밀 의학의 맥락에서 기계 론 적인 연구에 대 한 훌륭한 체 외에 도구를 구성 합니다. 사실, 이러한 세포 유전 배경 및 기증자, 결국 특정 돌연변이 수행 하 고 임상 조건, 나이, 성별, 라이프 스타일, 그리고 약물 등 특정 환자의 특성에 의해 영향을 받습니다. 또한, 다른 표식에 대 한 정렬 가능성 특정 C-MSC 하위 집합19의 연구를 허용할 수 있습니다.
C-MSC는 다른 심혈 관 질환, 주로 심장의 개장 하는 불리 한 특징에서 활성 플레이어 알려져 있습니다. 따라서, 그들은 심장 질환8,20중화 소설 치료 전략에 대 한 후보 대상을 나타냅니다.
C-MSC 줄기 같은 속성 및 그들의 부족의 중요 한 immunogenicity 심장 재생 의학에 대 한 세포 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 합니다. 실제로, 골 수 또는 다른 소스에서 MSC, 같은 C-MSC 잠재적으로 사용할 수 헌와 기증자와 받는 사람21사이 일치를 위한 필요 없이 allogenic 설정에서.
또한, C-MSC, 직접 심장 조직에서에서 고립 되는 심장 마이크로-환경과 epigenetic 프로 파일에 의해 preconditioned 되 고의 이점이 있다. 심장 재생 의학의 맥락에서 특히 중요 한 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다.
날짜 하려면, 재생 의학의 전 임상 연구 C-MSC 및 그들의 paracrine 활동18,,2223에 유용한 치료 가능성 확인. 중요 한 것은, 있는 셀 소스는 마음은 임상 시험 진행 cardiosfere 파생 셀 또는 C-MSC13,,2425의 부분 모집단 있습니다. 그러나, MSC 뼈 골 수 유래에 관해서는 다른 프로토콜 임상 등급 C-MSC26를 얻기 위해 필요한 수 있습니다.
C-MSC ACM에: 제시 프로토콜은 주로 endocardial 생 검 표시 된 병 리의 연구에 적합 하다. ACM 환자 진단 목적27bioptic 절차를 거칩니다. 그들의 심근 점차적으로 adipocytes과 섬유 증의 구성 전기 불활성 조직의 흉터 조직으로 대체 됩니다. 어디 진단 수율은 최대한, 흉터 영역에 bioptic 샘플링을 안내 하기 위해 endomyocardial 매핑 사용된10,,2829입니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 샘플 질병 심근의 테두리 영역에서 찍힌다.
Sommariva 외. 최근 ACM8, 때문에 그 마음에 preadipocytes는 엽 근원의 이다 C-MSC는 ACM 심장 지질에 적극적인 선수 시연의 병 인에서 C-MSC의 중추적인 역할을 정의 했습니다. 또한, C-MSC 격리 컨트롤 보다 지질 축적과 지질 둘 다 더 많은 경향을 보여 ACM 환자의 생 검에서 현재 프로토콜. 이러한 이유로,이 세포 일부 기계 연구9셀 모델의 적합성을 증명 하는 ACM의 분자 메커니즘을 확인 사용 수 있습니다.
제한 및 중요 한 단계: 환자 (단락 "가능한 응용 프로그램" 참조)에서 직접 C-MSC의 장점에도 불구 하 고이 프로토콜은 다른 제한을 받게 됩니다.
우선, 심장 bioptic 절차는 침략을 자주 엄격 하 게 필요한 경우. 실제로, 심장 조직 샘플링 윤리적으로 그리고 기술적으로 문제 이다. 심장 생을 수행 하기 위한 이유 차별 진단, 심장 이식의 상태를 모니터링 하거나 심장 종양30의 존재를 확인 cardiomyopathies의 맥락에서 확실 한 진단 달성 될 수 있습니다. 따라서, 단지 환자는 endomyocardial 생 검 합의 문을31 으로 표시 됩니다 C-msc 연구 등록할 수 있습니다. 또한, 심장 bioptic 절차 수 있다 임상 합병증, 특히 cardiomyopathic 마음에. 따라서, electrophysiologist의 samplings은 항상 신중 하 고 bioptic 샘플 셀의 절연 저하, 매우 작은 수 있습니다. 미래 실험 콜라 농도 조정 또는 소화의 타이밍이이 문제를 해결할 수 있습니다.
C-MSC, 모든 기본 인간 세포로 모든 고기에 다른 과목 중 높은 가변성을 표시 합니다. 실제로, 다른 과목에서 셀 변수 환경 조절에 다른 유전자 뿐만 아니라 또한 복종 있습니다. 특히,이 실험에서 세포 격리, 성장, 및 adipogenic 분화에 높은 가변성 관찰 됩니다.
현재의 프로토콜의 중요 한 단계는 인정 해야 합니다. Bioptic 샘플 모 세관을 포함 하는 경우 그들은 C-MSC 문화를 오염 시킬 수 있습니다 및 FACS 분석 (CD31 양성)에 의해 명시 될 수 있다 내 피 세포의 병렬 분리를 피하기 위해 제거 되어야 합니다. 효율적인 adipogenic 차별화를, 세포 활성 성장 단계에 있어야 합니다. 합류의 정도 지질 축적에도 영향을 미칠 수 있습니다.
방법의 중요성: 중간 엽 기질 세포의 고립의 이전 방법에 관하여 이것이 처음으로 인간의 심 실 bioptic 샘플에서 직접 C-MSC 획득의 설명 자세히 제시 된다. 이 메서드는 ACM 환자 샘플의 처리에 대 한 제안, 하지만 잠재적으로 심장 생 검 표시 된 모든 환자에 적용 됩니다.
이 프로토콜은 종종 수집 하기 어려운 더 큰 심장 샘플32필요한 셀의 획득에 대 한 이전 방법의 유용한 구현을 나타냅니다.
또한, 샘플 소스 흥미로운 혁신을 구성합니다. 심 실 생 심장33에 일반적으로 수행 하는 동안이 프로토콜 오른쪽 심 실 무료 벽에서 가져온 계정 샘플에 걸립니다. 병 오른쪽 심 실 지역에서 파생 된 셀 버스와 관련 된 질병의 pathologic 상태의 대표 될 수 있습니다.
또한, 현재 프로토콜에 사용 된 시 약의 일부는 다른 C-MSC 격리와 차별화 방법32에 관하여 다른. 예를 들어 콜라가이 원고에 제안 된 형식이 혼합 클래스 I 및 클래스 II collagenases 분해 활동의 균형 비율. 또한, 소화 솔루션 같은 기저 매체 (IMDM) C-MSC 문화 매체, 고립 된 C-MSC 미래 성장 조건에 적응할 수 있도록 준비에 대 한 사용에 녹아 콜라 혼합 구성 되어 있습니다.
또한, 비록 전체 C-MSC 인구를 사용 하 여 셀 배치를 표준화 수 정렬 절차만 이러한 셀의 플라스틱 준수 속성을 통해 고립, 단순화는 immunophenotypic를 변경 하지 않고 구성 C-MSC의 특성입니다. T. ADIPO이이 원고에 제안 된 구성 adipogenic 차별화, 피하 인슐린 같은 다른 구성 요소에 의해 유도 된 변화 dysregulation 이어질 수 있다.
오로 색도계 강도 평가에 근거 하는 지질 축적 정량화의 제안된 방법 방법 백분율을 기준으로 비교 하는 경우 누적된 지질의 수량에 대 한 더 많은 정보를 제공 하는 또한, 오로 얼룩 긍정적인 세포. 종종 지질 축적에 오로 추출 하 여 계량 소 프로 파 놀과 그 흡 광도 측정 셀으로. 그러나,이 메서드는 더 많은 구절을 필요로 하며 가변성 소 프로 파 놀 증발 때문에 복종 된다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품의 건강, 검색 전류 센트 Cardiologico Monzino-IRCCS에 이탈리아 정부에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
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