À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose
Summary
Nous quantifions la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose en utilisant deux méthodes. Tout d’abord, nous utilisons terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) in situ histologie pour déterminer les différences entre animaux infectés et cliniquement. En second lieu, nous effectuons une analyse des séries chronologiques de l’apoptose au cours de l’infection en utilisant une analyse de protéine caspase 3/7.
Abstract
Amphibiens subissent une grande perte de la biodiversité à l’échelle mondiale et une des principales causes est la chytridiomycose de maladies infectieuses. Cette maladie est causée par le champignon pathogène Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), qui infecte et perturbe l’épiderme de la grenouille ; Cependant, des changements pathologiques n’ont pas été explicitement caractérisés. L’apoptose (mort cellulaire programmée) peut être utilisé par des agents pathogènes pour endommager les tissus de l’hôte, mais peut aussi être un mécanisme de l’hôte de la résistance aux maladies pour éliminer les agents pathogènes. Dans cette étude, Nous quantifions la mort des cellules épidermiques des animaux infectés et, à l’aide de deux dosages différents : terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) et la caspase 3/7. Utilisant ventrale, dorsale et les tissus de la peau de la cuisse dans l’essai TUNEL, on observe la mort dans les cellules épidermiques in situ d’animaux infectés des cellules et comparer la mort cellulaire avec des animaux non infectés à l’aide de la microscopie de fluorescence. Afin de déterminer comment les niveaux de l’apoptose dans l’épiderme changent au cours de l’infection, nous retirer échantillons d’orteil-pointe toutes les deux semaines sur une période de 8 semaines et utiliser une analyse du caspase 3/7 avec des protéines extraites pour quantifier l’activité au sein des échantillons. Ensuite, nous corrélons activité de la caspase 3/7 avec la charge de l’infection. L’essai TUNEL est utile pour la localisation des cellules mort sur place, mais il est coûteux et temps intensif par échantillon. L’analyse du caspase 3/7 est efficace pour les vastes échantillons et l’heure du cours des expériences. Cependant, parce que grenouille orteil pointe des biopsies sont de petite taille il est extrait limité disponible de normalisation échantillon via des méthodes de quantification des protéines, tels que l’essai de Bradford. Nous proposons donc, estimation de la superficie de la peau grâce à l’analyse photographique des biopsies de l’orteil pour éviter de consommer des extraits au cours de la normalisation de l’échantillon.
Introduction
Amphibiens connaissent actuellement une les plus lourdes pertes de la biodiversité mondiale de n’importe quel taxons vertébrés1. Des principales causes de ce déclin sont la chytridiomycose maladie fatale de la peau, causée par le champignon pathogène Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. L’agent pathogène infecte superficiellement l’épiderme, ce qui peut conduire à la perturbation de la fonction de la peau entraînant une perte d’électrolytes sévère, un arrêt cardiaque et mort3. Divers mécanismes immunitaires hôte potentiel contre Bd sont actuellement à l’étude, tels que des peptides antimicrobiens4,5,6de la flore bactérienne cutanée, récepteurs de cellules immunitaires7,8, et lymphocytes activité9,10. Cependant, peu d’études explore si épidermique l’apoptose et la mort cellulaire est un mécanisme immunitaire contre ce pathogène mortel.
Mort cellulaire par apoptose (mort cellulaire programmée) ou de la nécrose (mort non programmée), dans l’épiderme peut être une pathologie de l’infection de la Bd . Des recherches antérieures suggèrent que l’infection Bd peut induire l’apoptose parce que la perturbation des jonctions intracellulaires est observée lorsque des explants de peau sont exposés au surnageants in vitrode la zoospore11. En outre, des modifications dégénératives épidermiques en Bd-grenouilles infectées sont observés à l’aide de la microscopie électronique12,13. Des analyses transcriptomiques indiquent que les voies de l’apoptose sont surexprimés dans la peau infectée14, et gymnophiones splénocytes apoptose lorsqu’elles sont exposées à la Bd surnageants in vitro15. Malgré l’augmentation du volume des éléments de preuve suggérant que la Bd peut induire l’apoptose et hôte cellulaire mort in vitro, études in vivo qui explorent ou mesurer l’apoptosis manquent de mécanismes par le biais de la progression de l’infection. En outre, on ne sait pas si l’hôte utilise l’apoptose comme une stratégie défensive de système immunitaire à combattre l’infection de la Bd , ou si l’apoptose est une pathologie de la maladie.
Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la mort des cellules épidermiques et l’apoptose dans des animaux infectés in vivo à l’aide de deux méthodes : l’analyse du protéine caspase 3/7 et terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) essai in situ avec. Comme chaque test détecte les différents aspects de la cellule mort16, ensemble ces méthodes fournissent une pleine compréhension des mécanismes impliqués dans la mort cellulaire et assurer une mesure précise de l’effet. L’analyse du caspase 3/7 quantifie l’activité d’effecteur caspases 3 et 7, qui permet la quantification des deux voies intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose. En revanche, l’essai TUNEL détecte de fragmentation de l’ADN, qui est causée par des mécanismes de mort cellulaire dont l’apoptose, nécrose et pyroptosis17. Nous utilisons l’essai TUNEL pour étudier l’emplacement de la mort cellulaire dans l’épiderme des animaux cliniquement infectés et non infectés à l’aide de trois sections différentes de la peau : la face dorsale, la Virginie et la cuisse de corroboree de Pseudophryne. Cette méthode identifie le site anatomique de la mort cellulaire, mais aussi distinguer son emplacement dans les couches épidermiques spécifiques. Nous utilisons ensuite l’analyse du caspase 3/7 pour réaliser une quantification de série de temps de l’apoptose dans une infection de 8 semaines en Litoria verreauxii alpina. Nous prenons orteil pointe échantillons tous les quinze jours de ces mêmes animaux et sont en mesure de la charge de l’infection pathogène en corrélation avec l’activité de la caspase 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons exploré l’apoptose épidermique et la mort cellulaire comme un mécanisme potentiel de pathologie de la maladie mortelle de chytridiomycose ou un mécanisme de résistance aux maladies chez les espèces sensibles de Bd . Nous avons utilisé deux méthodes d’évaluation de la mort cellulaire dans l’épiderme, essai TUNEL pour in situ l’analyse de mort de cellules épidermiques et l’analyse du caspase 3/7 pour le suivi de la mort des cellules épidermiques tout au long de la progress…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les personnes suivantes qui ont contribué à la collecte de données et de l’élevage : D. Thom, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. et T. Knavel ; et M. Merces d’assistance avec les dissections. Nous tenons également à remercier M. McFadden, P. Harlow et Taronga Zoo afin de déclencher le L. c. alpinaet G. Marantelli pour élever le corroboree P.. Nous remercions F. pierrat, A. Martel pour obtenir des conseils sur les dosages de l’apoptose, C. Constantine, A. Kladnik et R. Webb pour assistance avec essai TUNEL, et T. émético et W. Weßels pour aident avec le protocole et kit pour l’analyse du caspase 3/7. Ce manuscrit et le protocole est adaptée de Brannelly et coll. 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
