Summary

Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile

Published: May 16, 2018
doi:

Summary

İki yöntem kullanarak chytridiomycosis ile kurbağa epidermal hücre ölümü ölçmek. Öncelikle, terminal dUTP transferaz-aracılı nick son etiketleme (tünel) situ Histoloji klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanlar arasındaki farkları belirlemek için kullanabilirsiniz. İkinci olarak, biz bir caspase 3/7 protein analizi ile enfeksiyon üzerinde apoptosis bir zaman serisi analizi kuralları.

Abstract

Hem suda hem genel olarak biyolojik çeşitlilik içinde büyük bir kayıp yaşandığı ve bulaşıcı hastalık chytridiomycosis en önemli nedenlerinden biridir. Bu hastalığı mantar patojen bozar ve kurbağa epidermis bozan Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), tarafından neden olur; Ancak, patolojik değişiklikler açık olarak nitelendirmiştir değil. Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) patojenlerin ana bilgisayar dokusuna zarar için kullanılabilir ama aynı zamanda hastalık direnci patojen kaldırma için bir ana mekanizma olabilir. Bu çalışmada, biz iki farklı deneyleri kullanarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermal hücre ölümü ölçmek: terminal dUTP transferaz-aracılı nick uç-etiketleme (tünel) ve caspase 3/7. Ventral, sırt ve uyluk deri dokusu tünel assay olarak, biz gözlemlemek kullanarak klinik olarak enfekte hayvanların in situ epidermal hücre ölümünde hücre ve hücre ölümü floresan mikroskopisi kullanılarak bulaşmamış hayvanlarla karşılaştırın. Epidermis seviyelerinde apoptosis enfeksiyon boyunca nasıl değiştiğini belirlemek için iki haftada bir 8 haftalık süre içinde ayak ucu örnekleri kaldırmak ve caspase 3/7 tahlil etkinlik örnekleri içinde ölçmek için ayıklanan proteinler ile kullanın. Biz o zaman caspase 3/7 etkinlik enfeksiyon yük ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Tünel tahlil hücre ölüm situyerelleştirme için yararlıdır, ancak pahalı ve zaman örnek başına sahiptir. Caspase 3/7 tahlil örneklerin boyutu büyük ve zaman için verimli ders deneyler. Ancak, kurbağa ayak ucu biyopsisi küçüğüz çünkü mevcuttur sınırlı özü Bradford tahlil gibi protein miktar yöntemleri ile örnek standardizasyon. Bu nedenle, biz deri yüzey alanı örnek standardizasyon sırasında özleri tüketen önlemek için ayak biyopsi fotoğraf analizi ile tahmin öneririz.

Introduction

Hem suda hem şu anda herhangi bir omurgalı takson1küresel çeşitliliğin en büyük kayıp birini yaşıyorsunuz demektir. Bu düşüşler bir büyük mantar patojen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2tarafından neden ölümcül cilt hastalığı chytridiomycosis nedeni. Patojen yüzeysel deri işlevi şiddetli elektrolit kaybı, kalp krizi ve ölüm3bozulmasına yol açabilir epidermis bozar. Bd karşı çeşitli olası ana bilgisayar bağışıklık mekanizmaları şu anda, antimikrobiyal peptidler4,5, Kutanöz bakteriyel flora6, bağışıklık hücre reseptörleri7,8gibi incelendiği, ve lenfosit aktivite9,10. Ancak, epidermal Apoptozis ve hücre ölümü bu ölümcül patojen karşı bir bağışıklık mekanizması olup birkaç çalışmalar keşfedin.

Hücre ölümü, Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) veya nekroz (unprogrammed ölüm), epidermis ile bir patoloji Bd enfeksiyon olabilir. Önceki araştırma hücre içi kavşak çalışmasının ne zaman cilt explants zoospore supernatants vitro11‘ e. maruz kalır görülmektedir çünkü Bd enfeksiyon apoptosis neden olabilir gösteriyor Ayrıca, Bdepidermal dejeneratif değişiklikler-virüslü kurbağalar gözlenen elektron mikroskobu12,13kullanarak. Transcriptomic analizleri apoptosis yolları upregulated enfekte cilt14, ve onlar Bd supernatants vitro15‘ e maruz kaldığında apoptosis amfibi splenocytes tabi gösterir. Büyüyen birimin Bd tetikleyebilir öneriyor kanıt rağmen hücre Apoptozis ve ana bilgisayar ölüm vitro, keşfetmek veya mekanizmalar yoluyla enfeksiyon ilerleme eksik olan Apoptozis ölçmek in vivo çalışmalar. Ayrıca, ana Bd enfeksiyon mücadele için bir savunma bağışıklık strateji olarak apoptosis kullanıyorsa veya apoptosis bir patoloji hastalık ise bilinmemektedir.

Bu çalışmada, epidermal hücre ölümü ve Apoptozis iki yöntem kullanarak enfekte hayvan in vivo algılamaya yönelik: caspase 3/7 protein tahlil ve terminal dUTP transferaz-aracılı nick (tünel) in situ tahlil son etiketleme. Her tahlil hücre ölüm16farklı yönlerini algılarken, birlikte bu yöntemlerin hücre ölümüyle mekanizmaları tam bir anlayış sağlamak ve etkisi doğru bir ölçü olun. Caspase 3/7 tahlil miktar içsel ve dışsal apoptosis yollar sağlayan efektör caspases 3 ve 7, etkinlik quantifies. Buna ek olarak, tünel tahlil apoptosis, nekroz ve pyroptosis17de dahil olmak üzere hücre ölümü mekanizmaları tarafından neden olduğu DNA fragmantasyonu algılar. Tünel tahlil hücre ölümü üç farklı cilt bölümleri kullanarak hem klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermiste konumunu araştırmak için kullanıyoruz: patolojisi, venter ve Pseudophryne corroboreeuyluk. Bu yöntem anatomik site konumu belirli epidermal katmanlar içinde ayrım yanı sıra, hücre ölümü tanımlar. Daha sonra caspase 3/7 tahlil apoptosis Magno16 verreauxii alpinabir 8 haftalık enfeksiyonunda boyunca, bir saat serisi miktar yapmak için kullanın. Biz ayak ucu örnekleri iki haftada aynı hayvanlardan almak ve patojen bulaşma yük caspase 3/7 aktivite ile ilişkilendirmek edebiliyoruz.

Protocol

James Cook Üniversitesi L. v. alpinauygulamalarda A1875 P. corroboree ve A1897 ve A2171 için hayvan etik onayladı. 1. hayvancılık ve izleme Hayvan besleme ve zamanlama temizlik uygun bir su ile türler için uygun bir ortamda tek tek, ev. Hayvanlar her gün kontrol edin. Kritik tehlike altında Pseudophryne corroboree yetişkin bireylerin (tünel tahlil için Bölüm 4) kullanın ve tehdit Magno16 verreauxii alpina (Caspase 3/7 tahlil …

Representative Results

Tünel tahlil Vardı daha fazla tünel pozitif hücrelerinin virüslü hayvanlarda hastalık bulaşmamış tek denetim hayvanlarda. Tünel içinde hücreleri farklılık olumlu in situ konumunu enfekte ve hayvan kontrol. Denetim hayvanlarda vardı Tünel boyunca dermal ve epidermal hücre katmanları (bkz: şekil 1A) düşük seviyelerde cilt ama virüslü hayvanlarda tünel poziti…

Discussion

Epidermal Apoptozis ve hücre ölümü ölümcül hastalık chytridiomycosis patoloji veya bir mekanizma hastalık direnci Bd duyarlı türlerin potansiyel bir mekanizma olarak araştırılmalıdır. Biz hücre ölümü epidermis, in situ epidermal hücre ölüm analizi için tünel tahlil ve epidermal hücre ölümü boyunca enfeksiyon ilerlemesini izlemek için caspase 3/7 tahlil değerlendirilmesi için iki yöntem kullanılır. Hücre ölümü ve Apoptozis enfeksiyon yük ile correlated ve hücre ö…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hayvancılık ve veri toplama ile destekli aşağıdaki insanlar teşekkür: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, i. Harney ve T. Knavel; ve M. Merces diseksiyonlarının hakkında yardım almak için. Ayrıca M. McFadden, P. Harlow ve L. v. alpinayetiştirmek için Taronga Zoo ve G. Marantelli P. corroboreeyetiştirmek için teşekkür etmek istiyorum. F. Pasmans, A. Martel apoptosis deneyleri, C. ı. Konstantin, A. Kladnik ve R. Webb tünel tahlil, hakkında yardım almak için tavsiye için teşekkür ederiz ve T. Emeto ve W. Weßels için protokol ve caspase 3/7 tahlil için kiti ile yardımcı olur. Bu el yazması ve protokol Brannelly ve ark 2017 Eş J22. adapte

Materials

POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Play Video

Citer Cet Article
Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

View Video