新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離
Summary
人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.
Abstract
脳保護を改善し、脳を扱う脳ドラッグデリバリーを強化する約束を保持する新しい治療上の作戦の開発の重要な生理学的および病態生理学的条件下で血液脳関門の機能を理解、障害。ただし、ひと血液脳関門の機能を勉強するは困難です。したがって、適切なモデルの重要な必要性があります。この点で、人間の脳組織から分離した脳の毛細血管は、できるだけ人間体内の状況に近いとバリア機能を勉強するユニークなツールを表します。ここでは、高収率に一貫した品質と純度で人間の脳組織から毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルについて述べる。毛細血管は、機械の均質化、密度勾配の遠心分離、ろ過を使用して新鮮な人間の脳組織から分離されます。分離後、脳毛細血管のタンパク質発現と機能、酵素活性や細胞内シグナル伝達の研究に漏れの試金、ライブセル イメージング免疫アッセイなど様々 な用途に使用できます。分離脳の毛細血管は、ひと血液脳関門の機能調節を解明するユニークなモデルです。このモデルは、中枢神経系疾患を治療するための治療戦略の開発を助ける中枢神経系 (CNS) の病因に洞察力を提供できます。
Introduction
血液脳関門は、血液と何が入るし、脳から出てくるを決定する脳の間厳重に管理されたインターフェイスです。解剖学的, 血管内皮細胞は血液脳関門を作成し、複雑で、連続的な毛細血管網を形成します。生理、この毛細血管網は同時に炭酸ガスや代謝の廃棄物を処分しながら脳に酸素と栄養素を供給します。重要なは、証拠は、バリアへの変更が多数の病理学、アルツハイマー病、てんかん、脳卒中1,2,3,4,5などに貢献することをサポートしています,6,7. 脳血管内皮細胞はまた、例えば脳に薬剤の吸収をブロックすることによって治療にバリアとして役立つ、膠腫瘍切除術8,9,を次の化学療法。10. 分離脳毛細血管がバリア特性生体内でバリア機能と健康障害の研究では、これとよく似たユニークな体外血液脳関門モデルを表現するこの点では、疾患。この記事では、一貫して高品質の毛細血管で人間の脳から脳の毛細血管を分離し、血液脳関門の研究をもたらすのためのプロトコルを提供します。
1969 年に Siakotosら。11は、脳の毛細血管密度勾配遠心分離とガラス ビーズ列分離を用いたウシと人間の脳組織からの分離を報告する最初でした。その後、ゴールドスタインら12は、脳毛細血管グルコース輸送の代謝活性を維持しながら、ラットから分離された研究に必要な組織の量を削減する複数の濾過手順を追加することによってこの方法を改善しました。その後、研究者は何度もキャピラリー分離手順を最適化し、各イテレーション13,14,15法と脳毛細血管モデルを改善します。たとえば、Pardridgeら。16機械の均質化ではなく、酵素消化を使用して牛の毛細血管を分離し、210 μ m のメッシュ フィルターとガラス ビーズの列を介して毛細血管の懸濁液をその後渡されます。これらの変更は、分離脳毛細血管のトリパン ブルー色素排除汚れを改善し、したがって、内皮細胞生存率を増加します。1990 年代初頭にダレールら。17は、γ – グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTase) およびアルカリホスファターゼの代謝活性を維持され神経汚染の明確なウシおよびラットの毛細血管を分離しました。2000 年、ミラーら。18毛細血管の内腔に輸送基質の蓄積を共焦点顕微鏡との組み合わせでラットとブタ脳毛細血管を使用しました。その後、当研究室は、脳毛細血管分離手順を最適化するために続けているし、P-糖タンパク質 (P gp)19,20,21, 乳癌を決定する輸送アッセイを設けて抵抗蛋白質 (BCRP)22,23日、多剤耐性蛋白質 2 (Mrp2)24交通活動。2004 年、我々 は様々 なシグナル伝達経路を調査するラット脳毛細血管を用いて 2 つのレポートを公開しました。ハルツら。21、そのペプチドのエンドセリン 1 急速かつ可逆的減少 P gp トランスポート機能 (PKC) エンドセリン受容体 B (エB) 受容体、一酸化窒素合成酵素 (NOS) および蛋白質キナーゼ C を介して作用することにより脳の毛細血管でわかりました。バウアーらで19、我々 は核内受容体有する X レセプター (PXR) の発現と脳の毛細血管で P gp 式とトランスポート機能の示した PXR 変調を実証しました。遺伝子組換えヒト PXR マウスでの実験、研究のこのラインを拡大し、体内バリアにより骨折 P gp hPXR 活性化25まで引き締めを示した。2010 年にハルツら。26 P gp タンパク質発現を復元し、トランスポート ノザン ハップ トランスジェニック人間アミロイド前駆体タンパク質 (ハップ) マウスの動作このアプローチを使用します。また、ハップの P gp を復元するマウス大幅削減アミロイド β (a β)40と a β42の脳レベル。
シグナル伝達経路を検討するほか、分離脳の毛細血管は毛細血管漏出として参照する毛細血管の透過性の変更を確認する使用できます。特に、テキサス赤の漏出試金は、時間とこれらのデータで毛細血管の内腔からテキサス赤は漏洩率を分析に使用し、蛍光色素の漏出を評価するために使用されます。コントロールの毛細血管からのそれらと比較して増加した毛細血管漏出率は、血液-脳関門2の物理的な整合性の変化を示します。バリア、例えばに関連付けられている多くの病気の状態があるので、これは貴重な、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳傷害27,28,29、。 30です。他のグループはまた蛋白質の表現、蛋白質31,32,33,34,の輸送活性を調節するシグナル伝達経路を識別する孤立した毛細血管を利用します。 35,36,37。最後に、人間の脳の毛細血管を分離するためこのメソッドを最適化してまいりましたし、最近、我々 はてんかん発作のない制御個人38 に比べて患者におけるひと血液脳関門で P gp 発現の増加を示した.一緒に取られて、これらの開発は、分離脳の毛細血管がバリア機能を勉強する汎用的なモデルとして使用できることを示します。
様々 な体外体内、および体外血液脳関門モデルの基礎研究および産業創薬スクリーニング、脳39,報40,41 への薬物送達をテストの目的で主に使用されています。 ,42,43,44。脳毛細血管分離前のヴィヴォに加えてには現在血液脳関門モデル、インシリコモデル、分離脳毛細血管内皮細胞の様々 な由来不死化細胞株の in vitro細胞培養種の培養脳内毛細血管内皮細胞とマイクロ流体チップのモデルに区別するひと多能性幹細胞 (hPSC) の文化。
インシリコモデルは、予測吸収、分布、代謝、排泄 (ADME) プロパティに基づく新薬候補を選択するため医薬品開発で最も一般的に使用されます。定量的構造物性相関 (QSPR) モデルなど量的な構造活動関係 (QSAR) モデル メソッドは、脳浸透薬剤の候補者を予測するライブラリの高スループット スクリーニングで使用される人気のあるメソッド45,46. これらのモデルは、バリア貫通性の分子を画面に便利。
ベッツら47は、体外血液脳関門モデル システムとしての培養脳内毛細血管内皮細胞の単分子膜を設立しました。人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMECs) など新鮮な組織や不死化血管内皮細胞を用いて細胞文化モデルの in vitro脳浸透または機構研究のための別の高スループット スクリーニング ツールをすることができます。ただし、脳毛細血管内皮細胞培養モデル毛細血管の内腔内の血流の生理学的な剪断応力がない、全体的な生物学的複雑さに限られている、重要なバリア成分の発現や局在の変化を受けタイト結合タンパク質など表面の受容器、トランスポーター、酵素、イオン チャンネルは48,49,50。逆に、内皮細胞膜に由来する hPSCs hCMEC/D3 の文化と比較して低糖透磁率がある、いくつかの血液脳関門輸送、接着分子、タイトな接合51,の偏光式が含まれて52です。 しかし、これらの細胞も文化でのプロパティの変更は、体内バリアのプロパティ52・のシステムを検証する必要があります。
血液脳関門の研究の新しい動向、マイクロ流体デバイスを生成する臓器・ オン ・ チップ技術を使用してまたは中空繊維技術53,を利用した人工の毛細血管を作成する 3 D 培養システムを利用54,55。 人工の毛細血管、脳毛細血管 (3-7 μ m) よりも大幅に大きい直径 (100-200 μ m) があります。したがって、せん断力、体外で完全に似ていない体内状況。これは、”blood-brain-barrier-on-a-chip”マイクロ流体デバイス、マイクロ流体せん断力を生成するこれらのデバイスを人工膜フォームの「血」と「脳」のコンパートメントと流体を励起しているに扱われます。同様に、アストロ サイトのさまざまな組み合わせで血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の共培養もで使用されている中空繊維技術体内条件56下の粘弾性パラメーターを再作成するには,57,58です。 ただし、わかりにくい方法もこのモデルは血液脳関門輸送、代謝、シグナル伝達、などなどの他のプロパティを反映します。これらの人工毛細血管とチップのモデルは薬の高スループット スクリーニングに適したが、文化の中に、これらのモデルを生成するために使用するセルが予告なく変更も。
冷凍と固定脳スライスまたは原発性脳毛細血管内皮細胞の文化は人間の血管を研究5,59,60,61に使用することができます追加のモデル。たとえば、固定脳組織の免疫組織化学を使用して蛋白質のローカリゼーションを決定、健康式は病気にかかったティッシュと比較します。
組織スライスとの in vitroモデルに加えて上記、新鮮な分離脳の毛細血管は血液脳関門の機能を研究する利用できます。この孤立した毛細血管モデルの制限新鮮な人間の脳組織を取得する難しさを含んで比較的時間のかかる分離プロセスと神経細胞、アストロ サイトの不在。分離脳毛細血管モデルの利点は、このモデル体内状況を密接に似ているし、したがって、バリア機能不全の評価に使用できます。重要なは、試金および分子生物学手法3,19,,6263の多数を使用してシグナルを見分けることも使用することができます。
加齢に関するサンダース ブラウン センターを介して両方の生鮮、冷凍人間の脳組織へのアクセス研究室 (IRB #B15-2602-M)64。このコンテキストで解剖標準プロトコルに従う、脳には求め < 4 h、およびすべての手順は NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に適合。人間の脳組織へのこのユニークなアクセスを与えを設置し、そのまま、実行可能な人間の脳の毛細血管の高収率の結果人間の脳から脳の毛細血管を分離するためのプロトコルを最適化します。関心の 2 つの一般的なエンドポイントは、タンパク質の発現と活性を決定します。この点で、我々 と他の蛋白質の表現および活動レベルを勉強する分離脳の毛細血管で使える様々 なアッセイを設けてください。これらのアッセイは、西部にしみが付くこと、シンプルなウエスタン アッセイ、酵素免疫測定法 (ELISA)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、ザイモグラフィー、輸送活動のアッセイと毛細血管漏出試金。これらの試できる研究者が人間の病理学的条件でバリア機能の変化を研究、蛋白質の表現や活動を支配する経路を決定する、関連付けられている血液脳関門の治療のための薬理学的ターゲットを特定するには病気。
一緒に、新鮮な分離脳の毛細血管は血液-脳関門の堅牢かつ再現可能なモデルとして利用できます。特に、このモデルは、さまざまなバリア機能を勉強するエンドポイントを決定する多くの異なるアッセイと組み合わせることができます。
Protocol
以下の情報は、現行の安全およびケンタッキーの大学, レキシントン、ケンタッキー、米国で規制の基準に基づいています。安全対策として人間の組織で作業する前に機関の生物学的安全プログラムと最新の規則と推奨事項を参照してください。 注意: 人間の組織は、ひと免疫不全ウイルス (HIV)、B 型肝炎ウイルス (HBV)、C 型肝炎ウイルス (HCV) を含む血液媒介病原体の源?…
Representative Results
人間の脳組織から分離は、大きな船、赤の血液細胞、他の単一セル、いくつかの細胞の残骸の量が少ない人間の脳毛細血管 (図 1 b) の濃縮懸濁液をもたらします。いくつかの毛細血管を分岐すると、そして、いくつかは、赤血球が毛細血管の内腔に捕捉されました。典型的な毛管 3-7 μ m の直径を持つ、約 100-200 μ m; オープン ルーメンと長いほと…
Discussion
この議定書では、新鮮な組織からそのままで、実行可能な人間の脳毛細血管の分離について説明します。次の詳細に議論我々 このセクションで: 1) プロトコル、2) の一般的なエラーのトラブルシューティング、手法の限界 3)、4) に関して、既存モデルと代替血液脳関門モデルの意義への変更と 5)。分離脳毛細血管の潜在的なアプリケーション。
ここで説明されているプ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は感謝し、ピーター ネルソン博士とすべての人間の脳組織サンプルを提供するため英国 ADC 脳組織銀行でソニア ・ アンダーソンを認める (NIH 付与数: 国立老化研究所から P30 AG028383)。グラフィカルな援助、マット ・ ハザードとトム ・ ドーラン、情報技術サービス、学術技術と学部婚約、ケンタッキー大学に感謝しますこのプロジェクトはだった (B.B.) に国立神経疾患と脳卒中から許可番号 1R01NS079507 によって (A.M.S.H.) に国立老化研究所から許可番号 1R01AG039621 でサポートされています。内容は著者の責任と高齢化に関する国立研究所の神経疾患と脳卒中や国立研究所の公式見解を必ずしも表さない。著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Materials
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4°C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 ml syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 ml volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 ml volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 l Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 l Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 ml) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri Dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS – part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
References
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Citer Cet Article
Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).