신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

Summary

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

Abstract

생리 및 병 태 생리 조건 이해 혈액-뇌 장벽 함수는 두뇌 약물 전달 향상, 두뇌 보호, 개선 및 두뇌 치료 약속을 잡고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 중요 한 장애입니다. 그러나, 인간의 혈액-뇌 장벽 기능을 공부 하 고 도전 이다. 따라서, 적절 한 모델에 대 한 중요 한 필요는. 이와 관련, 뇌 모세 혈관 뇌 조직에서 분리 가능한 상황 인간의 vivo에서 가까운으로 장벽 기능을 공부 하는 독특한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 일관 된 품질과 순도 높은 수확량에서와 인간의 뇌 조직에서 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 모세 혈관에서 신선한 인간의 뇌 조직의 기계적 균질, 밀도 기울기 원심 분리, 여과 사용 하 여 격리 됩니다. 격리, 후 인간의 뇌 모세 혈관 단백질 표정 그리고 기능, 효소 활동, 또는 세포내 신호를 공부 하 누설 분석 실험, 라이브 셀 이미징 및 면역 기반 분석 등의 다양 한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 고립 된 인간의 두뇌 모세는 인간의 혈액-뇌 장벽 기능의 규정 명료 하 독특한 모델입니다. 이 모델은 중앙 신경 조직 (CNS) 병 인, CNS 질환 치료를 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

혈액-뇌 장벽 혈액과 무슨 들어가는 및 두뇌에서 결정 하는 뇌 간의 긴밀 하 게 제어 인터페이스입니다. 해부학, 내 피 세포 혈액-뇌 장벽을 구성 하 고 복잡 한, 지속적인 모 세관 네트워크를 형성 한다. 순수,이 모 세관 네트워크는 동시에 이산화탄소와 대사 폐기물의 처분 하는 동안 산소와 영양소와 뇌를 제공 합니다. 중요 한 것은, 증거는 배리어에 변화 Alzheimer의 질병, 간 질, 및 뇌졸중^1,2,3,,45 를 포함 하 여 수많은 병 리에 기여 지원 ^{, 6 , 7}. 뇌 내 피 세포도 예뇌에 약물 흡수를 차단 하 여 치료에 방 벽으로 봉사., 화학 요법 세포종 님 다음 종양 절제술^8,9, 의 ¹⁰. 이와 관련, 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관 대표는 독특한 비보 전 혈액-뇌 장벽 모델을 밀접 하 게 유사한 방 벽 속성 vivo에서, 장벽 기능 및 건강 장애의 연구에 대 한 수 있는 그리고 질병입니다. 이 문서에서 우리는 프로토콜 일관 되 게 높은 품질을 모 세관에 인간의 뇌에서 뇌 모세 혈관을 분리 하 고 혈액-뇌 장벽 공부 항복을 제공 합니다.

1969 년에, Siakotos 외. ¹¹ 뇌 모세 혈관 밀도 그라데이션 원심 분리와 유리 구슬 열 분리를 사용 하 여 소 하 고 인간의 뇌 조직에서의 격리를 보고 하는 첫번째 이었다. 나중에, 골드 스 테 인 외. ¹² 조직의 포도 당 수송의 신진 대사 활동을 유지 하면서 쥐에서 고립 뇌 모세 혈관을 공부 하는 데 필요한 금액을 줄이기 위하여 여러 여과 단계를 추가 하 여이 메서드를 향상. 그 이후, 연구자 최적화 모 세관 격리 절차 여러 번, 각 반복^13,,1415방법과 뇌 모 세관 모델을 개선. 예를 들어 Pardridge은 외. ¹⁶ 소 모 세관 기계적 균질, 보다는 오히려 소화 효소를 사용 하 여 격리 하 고 이후에 전달 210 µ m 메쉬 필터와 유리 구슬 열을 통해 모 세관 서 스 펜 션. 이러한 수정 고립된 뇌 모세 혈관의 trypan 블루 제외 얼룩을 개선 하 고 따라서 내 피 세포 생존 능력을 증가. 1990 년대 초에, Dallaire 외. ¹⁷ 격리 소 및 쥐 모 세관 신경 오염의 명확 했다 고 γ glutamyl transpeptidase (γ-GTase)와 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 대사 활동을 유지. 2000 년에, 밀러 외. ¹⁸, 모세 혈관의 루멘으로 전송 기판의 축적을 보여 confocal 현미경 검사 법와 함께에서 고립 된 쥐와 돼지의 뇌 모세를 사용. 그 후, 우리의 실험실 뇌 모 세관 격리 절차를 최적화 하기 위해 계속 하 고 우리는 P-당단백질 (P-gp)^19,,2021, 유방암을 결정 하기 위해 전송 분석 설립 저항 단백질 (BCRP)^22,23, 그리고 다중 약물 저항 단백질 2 (Mrp2)²⁴ 전송 활동. 2004 년, 우리는 우리가 다양 한 신호 경로 조사 하기 위해 고립 된 쥐 뇌 모세 혈관을 사용 하는 두 가지 보고서 출판. 츠 외에 ²¹, 우리는 펩 티 드 endothelin 1 신속 하 고 역 감소 뇌 모세 혈관 endothelin 수용 체 B (동부 표준시_B) 수용 체, 산화 질소 synthase (NOS), 그리고 단백질 키 니 아 제 C 통해 행동에 의해 (PKC)에서 P의 gp 전송 기능 발견. 바 우 어 외 에 ¹⁹, 우리 핵 수용 체 pregnane X 수용 체 (PXR)의 표현과 보였다 PXR 변조 뇌 모세 혈관에서 P의 gp 식 및 전송 기능을 시연 했다. 유전자 변형 인간 답게 PXR 마우스 실험에서 우리 연구의이 라인을 확장 하 고 hPXR 활성화²⁵통해 upregulating P-gp에 의해 방 벽의 강화 vivo에서 보여주었다. 2010 년에 츠 외. ²⁶ P gp 단백질 표정 복원 및 수송 행복해 overexpress 유전자 변형 인간 녹말 체 선구자 단백질 (행복해) 생쥐에서 활동이 접근이 방식을 사용. 또한, P의 gp 행복해 복원 마우스 크게 감소 녹말 체 beta (Aβ)₄₀와 Aβ₄₂두뇌 수준.

신호 경로, 공부 뿐만 아니라 모 세관 누설을 지칭 하는 모 세관 침투성에 있는 변화를 결정 하 고립 된 뇌 모세 혈관을 사용할 수 있습니다. 특히, 텍사스 레드 누설 시험 시간 및 이러한 데이터 모 세관 루멘에서 텍사스 레드는 누설 률을 분석 하는 데 사용 하는 형광 염료의 누출을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 증가 모 세관 누설 률 제어 모 세관에서 그에 비해 혈액-뇌 장벽²의 물리적 무결성에 변화를 나타냅니다. 이것은 가치가 장벽 장애, 예를 들어와 관련 된 수많은 질병 상태 이기 때문에., 간 질, 다 발성 경화 증, 알 츠 하이 머 병, 그리고 외상 성 뇌 부상^27,,2829, ³⁰. 다른 그룹 또한 단백질 표정 및 단백질^{31,32,,3334의 전송 활동 신호 경로 분별 하 고립 된 모 세관 이용 35,,3637}. 마지막으로, 우리는 인간의 뇌 모세 혈관의 격리에 대 한이 메서드를 최적화 하기 위해 지속적으로 그리고, 최근에, 우리가 보여주었다 증가 P gp 식 환자에서 인간의 혈액-뇌 장벽에서 간 질 발작-무료 제어 개인^{38에 비해} . 함께 찍은, 이러한 발전 고립된 뇌 모세 혈관 장벽 기능을 공부 하는 다재 다능 한 모델으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

Vivo에서, ex vivo, 및 혈액-뇌 장벽 모델 생체 외에서 다양 한 기초 연구와 산업 약물 검사, 약물 전달 뇌^{39,40,41에 테스트 목적으로 주로 사용 된 ,42,,4344}. 격리 된 비보 전 뇌 모세 혈관, 뿐만 아니라 현재 혈액-뇌 장벽 모델 포함 철에 모델, 체 외에서 세포 배양 고립된 뇌 모 세관 내 피 세포 또는 다양 한에서 불멸 하 게 셀 라인의 종, 뇌 모 세관 내 피 세포, 및 칩에 미세 모델으로 차별화 하는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 생체 외에서 문화.

실리콘에서 모델 예측된 흡수, 분포, 대사, 배설 (ADME) 속성에 따라 약 후보자를 선택 하기 위한 약물 개발에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 양이 많은 구조 재산 관계 (QSPR) 모델 같은 양이 많은 구조 활동 관계 (굽기) 모델은 라이브러리의 높은 처리량 검열에 사용 하는 약물의 뇌 침투를 예측 하는 인기 있는 방법 ^{45 , 46}.이 모델은 화면 분자 배리어 관통 속성에 대 한 유용.

베 츠 외. ⁴⁷ 는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 모델 시스템으로 교양된 뇌 모 세관 내 피 세포의 monolayers를 설립. 인간의 대뇌 microvessel 내 피 세포 (hCMECs) 등 신선한 조직 또는 불멸 하 게 내 피 세포를 사용 하 여 셀 문화 모델 생체 외에서 뇌 침투 또는 기계 론 적인 연구에 대 한 또 다른 높은 처리량 검열 도구 수 있습니다. 그러나, 뇌 모 세관 내 피 세포 문화 모델 모 세관 루멘 내의 혈의 생리 전단 응력 부족, 전반적인 생물 학적 복잡성에 제한 됩니다 및 식 및 중요 한 장벽 부품의 지역화에 변화를 받아야 꽉 접합 단백질 같은 표면 수용 체, 전송기, 효소, 그리고 이온 채널^48,,4950. 반대로, 내 피 monolayers hPSCs에서 파생 된, hCMEC/D3 문화에 비해 낮은 자당 침투성이 있고 일부 혈액-뇌 장벽 전송기, 접착 분자, 그리고 단단한 접속점^51, 의 편광된 식 포함 ^{그러나 52}., 이러한 셀 속성에에서 변경 될 수 있으며 시스템 장벽 속성⁵² vivo에서 의 재현 부에 대 한 유효성을 검사 해야 합니다.

혈액-뇌 장벽 연구의 최신 동향 등 인공 모세 혈관, 기관-온-칩 기술을 사용 하 여 미세 장치 생성 또는 빈 섬유 기술^53, 를 활용 하 여 만드는 3D 조직 문화 시스템을 활용 하 여 ^{54 , 그러나 55}. 인공 모세 혈관,, 있다 뇌 모세 혈관 (3-7 µ m) 보다 훨씬 더 큰 직경 (100-200 µ m). 따라서, 전단 세력에는 생체 외에서 할 하지 완전히 닮은 vivo에서 상황. 이것은 “blood-brain-barrier-on-a-chip” 미세 장치, 미세 전단 힘을 생성 하는 이러한 장치를 통해 인공 막 형태 “피”와 “두뇌” 구획 및 유체 펌핑은 해결 되었습니다. 마찬가지로, 다양 한 조합 이다와 내 피 세포와 혈관 평활 근 세포의 공동 문화 또한 사용 되었습니다 빈 섬유 기술을 vivo 조건⁵⁶ 에서 존재 하는 유 변 학적 매개 변수를 다시 ^{, 57 , 그러나 58}., 그것은 불분명이 모델 혈액-뇌 장벽 교통, 신진 대사, 신호, 등 등의 다른 속성을 반영 하는 얼마나 잘. 이러한 인공 모 세관 및 칩 모델은 약물의 높은 처리량 검열에 적합 하지만 이러한 모델을 생성 하는 데 사용 되는 세포 문화 중 변경 될 수 있습니다.

고정 및 고정 뇌 조각 또는 모 세관 내 피 세포 배양인간 microvasculature 연구^5,59,,6061하는 데 사용할 수 있는 추가 모델은 기본 두뇌. 예를 들어 고정된 뇌 조직의 immunohistochemistry 단백질 지역화가 결정 하는 데 사용은 고 식 건강 한 병에 걸리는 조직에 비해.

조직 조각 및 생체 외에서 모델 위에서 설명한, 갓 고립 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽 기능을 공부에 활용할 수 있습니다. 신선한 인간의 뇌 조직, 얻을 하는 데 어려움이 고립 된 모 세관 모델의 포함 이다 신경, 그리고 상대적으로 시간이 많이 걸리는 격리 프로세스의 부재. 격리 된 뇌 모 세관 모델의 한 장점은이 모델 밀접 하 게 비보에 상황을, 따라서, 장벽 기능 및 역 기능 특성을 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 신호 메커니즘을 사용 하 여 다양 한 분석 및 분자 기법^3,19,,6263분별을 사용할 수 있습니다.

우리의 실험실 권한이 모두 신선 하 고 냉동 인간 두뇌 조직에 노화에 샌 더 스 브라운 센터를 통해 (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. 이러한 맥락에서 부검 표준 프로토콜에 따라, 두뇌에서 얻을 수 있습니다 < 4 h, 및 모든 절차 준수 NIH Biospecimen 최상의 연습 지침⁶⁵. 인간의 뇌 조직에이 독특한 접근을 감안할 때, 우리는 설립 하 고 그대로, 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 고수익에 결과 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 프로토콜을 최적화. 관심의 두 가지 일반적인 끝점 단백질 식 및 활동을 결정 하는. 이와 관련, 우리와 다른 단백질 표정 활동 레벨을 공부 하 고 격리 된 뇌 모세 혈관으로 사용할 수 있는 다양 한 분석을 설립 했다. 이 분석 실험 등 서 부 럽, 간단한 서양 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), zymography, 전송 활동 분석 실험, 그리고 모 세관 누설 분석 실험입니다. 이 분석 실험 허용 인간 pathologic 상태에서 장벽 기능에 변화를 공부 단백질 식 및 활동, 관리 하는 경로 확인 하 고 혈액-뇌 장벽 관련 치료에 대 한 약리학 적인 목표를 식별 하 연구원 질병입니다.

함께, 갓 찍은 고립된 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽의 강력 하 고 재현 가능한 모델로 사용할 수 있습니다. 특히,이 모델 다양 한 장벽 기능을 공부 하는 끝점을 확인 하기 위해 많은 다른 분석 실험 결합 될 수 있다.

Protocol

아래 내용은 현재 안전 및 규제 표준 켄터키의 대학, 렉 싱 턴, 켄터키, 미국에서 기반으로 합니다. 안전 예방책으로 서 인간의 조직으로 작업 하기 전에 기관의 생물 안전 프로그램 최신 규정 및 권장 사항을 참조 하십시오. 주의: 인간의 조직 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 및 다른 사람을 포함 하 여, 혈액을 매개로 병원 균의 …

Representative Results

인간의 뇌 조직에서 격리 큰 혈관, 적혈구, 다른 단 세포와 일부 세포 파편의 작은 양의와 인간의 뇌 모세 혈관 (그림 1B)에 농축 현 탁 액을 산출 한다. 일부 모 세관, 분기 하 고, 일부, 적혈구는 모 세관 루멘에서 속은. 일반적인 모 세관 3-7 µ m 직경을가지고 있으며 약 100-200 µ m 오픈 루멘;와 긴 대부분 모 세관 끝 축소 됩니다. Confocal 현미경 검사 법을…

Discussion

현재 프로토콜 신선한 조직에서 그대로 하 고 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 격리를 설명합니다. 이 섹션에서 우리에 대해 자세히 다음: 1) 프로토콜, 2) 일반적인 오류 문제 해결, 3) 기술의 한계, 4) 기존 기준 모델 및 대체 혈액-뇌 장벽 모델의 중요성에 대 한 수정 및 5) 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관에 대 한 잠재적인 응용 프로그램입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 신선한 …

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, USA	32916-636	PPE
Disposable Protective Labcoats	VWR, Radnor, PA, USA	470146-214	PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	19460102	PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	14-206-32	to cover working areas
VWR Sharps Container Systems	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75800-272	for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz	UK Supply Center, Lexington, KY, USA	323775
Equipment
4°C Refrigerator	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	AB15
Heidolph RZR 2102 Control	Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75004521
Leica L2 Dissecting Microscope	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA		used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer	Kinematica AG, Luzern, Switzerland	9158168
Scale P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, USA	0191392
Standard mini Stir	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA	11-670-4C	used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance	OHAUS, Parsippany, NJ, USA	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA		used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377823T1	wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377821T1	resuspend pellet in BSA
Pipet Boy	Integra, Hudson, NH, USA	739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs	VWR, Radnor, PA, USA	21008-951
EISCO Scalpel Blades	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	S95938C	to mince brain tissue
PARAFILM	VWR, Radnor, PA, USA	52858-000	to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21-377-304	to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	BD309653	used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10060-13	used for mincing
Dumont Forceps #5	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11251-10	used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3431E25	50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer	VWR, Radnor PA USA	62400-642	15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA	146424	Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm)	pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany	43-50030-03
Connector Ring	pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany	41-50000-03	reuse multiple time
1 l Volumetric Flask			for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker			for preparation of 1% BSA
Stir Bar			for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml)			for preparation of Ficoll®
Ice Bucket			to keep everything cold
100 mm Petri Dish			for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper	VWR, Radnor, PA, USA	89260-222	to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647-500g	prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F4375	Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G7528	Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	71474	to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P2256	Concentration: 1 mM