GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출
Summary
있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의 사전
Abstract
인간의 대 장 암 (CRC) 치료에 현재 진보에도 불구 하 고 몇 가지 근본적인 치료는 CRC의 늦은 단계에 대 한 효과적입니다. 전 임상 모델으로 오래 된 인간의 암 세포 선 및 종양 모델 개발 되었습니다 많은 유전자 변형 마우스를 사용 하 여 종양이 종이 식 마우스 모델이 임상 문제를 극복 한다 그들은 부분적으로 인간의 carcinomas의 기능을 모방 하지만 종종 내 습 및 전이 포함 하 여 인간 악성의 주요 측면 정리를 하지. 따라서, 더 나은 인간 CRC에 악성 진행을 대표 하는 대체 모델은 오랫동안 기다려온 되었습니다.
우리는 여기 작은 CRC 조각 수술 환자에서 해 부의 피하 주입에 의해 종양 환자 파생 xenografts (PDXs)의 생성을 보여줍니다. 콜론 PDXs 개발 하 고 histopathologically 환자에 CRC를 닮은. 그러나, 몇 가지 자연 micrometastases는 PDX 모델에 영향을 받는 먼 기관의 기존 횡단면에서 감지. 먼 장기에 전이성 보급의 탐지를 촉진 하기 위하여 우리는 문화에서 콜론 PDXs에서 종양 organoid 세포를 추출 하 고 GFP lentivirus 매우 immunodeficient 끄 덕/시-scid IL2Rγ에 주입 하기 전에 그들을 감염null (노 그) 쥐. Orthotopically 주입 PDX 파생 CRC organoid 세포 지속적으로 양식 기본 종양 긍정적인 GFP에 대 한 받는 사람 쥐에서. 또한, 자발적으로 식민지 GFP 표현 특히 형광 현미경 검사 법에 의해 이러한 쥐의 폐에서 감지 micrometastatic 개발. 또한, CRC organoids의 intrasplenic 주입 자주 간 식민지를 생성합니다. 함께 찍은, 이러한 결과 다단계 프로세스 동안 시각적으로 감지 되도록 PDX 파생 CRC organoid 셀 GFP 표시 되 나 침공 전이 캐스케이드 나타냅니다. 설명된 프로토콜 GFP lentiviral 입자에 의해 불리고 해당 CRC organoid 셀의 3D 문화와 인간의 CRC의 PDXs의 설립을 포함 한다.
Introduction
대 장 암 (CRC)은 암 사망 세계1의 두 번째 주요 원인. 고급 단계 질병을 가진 환자의 일반적인 치료에 부족 한 응답 CRCs를 근본적으로 치료 하는 시도의 무효를 나타냅니다. 더 효과적인 치료 접근을 개발 하기 위해 Crc의 특성을 모방 하는 암의 다양 한 전 임상 마우스 모델 설립 되었습니다. 다양 한 CRC 셀 라인 생성 종양 xenografts 그들의 편 및 조작의 용이성 때문에 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 암 세포 선의 장기 문화는 다양 한 독특한 세포 인구 꽤 특정 문화 조건 하에서 증식을 함으로써 신뢰할 수 없는 결과 및 전 임상 약에서 중요 한 제한의 결과로 종종 발생 개발입니다.
되지 않고 교양 생체 외에서, 종양 환자 파생 xenografts (PDXs) 또한 인간의 CRC 조직 수술 환자2,,34에서 해 부의 동물 모델에 이식 하 여 생성 된. PDXs는 업과 주요 histopathological 기능으로 널리 인식 되 고 유전 변경 원래에서 파생 된 환자의 종양에 존재. 또한, 종양 환자에서 파생 된 organoids 구성 종양 세포 클러스터 밀접 하 게 원래 종양5,6의 생물 학적 속성을 유사 3D 조건 문화에 의해 설립 되었다. 이러한 종양 organoids 또한 설계5맞춤된 치료를 함으로써 높은 처리량 마약 검사에 적용 했다. 그러나, 현저 하 게 다른 유형의 CRC 인구 간주 됩니다 종양 내의 질량. 특정 CRC 인구 수 선택적으로 증식 한 PDX와 종양 organoids의 구절의 vivo에서 그리고 생체 외에서 시리즈 중 각각 확장 합니다. 이 또한 수 있습니다 전체 진 식 프로필과 피/유전 상태를 변경 하려면 영향을 받는 CRCs의 그로 인하여 부모의 CRC에 최소한의 닮 았에서 결과.
환자에서 파생 된 CRC organoids와 noncancerous 인간 결 장 종양 돌연변이의 조합 또한 종양 침입과 전이 에 의해 궁 행 하는 인간의 종양 세포의 특징을 조사 하기 위해 고용 되었습니다 하버 설계에서 추출 6,7,,89. 그러나, immunodeficient 쥐로 orthotopic 이식 환자에서 파생 된 CRC에서에서 발생 하는 자연 스러운 전이의 발생률이 매우 낮은 했다 포함 하는 침략 전이 캐스케이드의 다단계 과정을 공부 하기 어려운 지역 내 습, intravasation, 혈 류, 넘쳐 흐름 및 먼 장기4,10의 식민지에서 전송. Micrometastasis로 ≤2 m m의 종양 세포 증 착에 의해 표현, CRC organoids 환자에서 파생 된에 의해 형성 된, 실험 마우스 모델에 영향을 받는 먼 장기에서 섹션의 histopathological 분석에 간과. 자연 스러운 micrometastases의 시각화 최소한의 비보에 효율적으로 받는 쥐로 그들의 주입 전에 종양 organoid 세포에 형광 마커를 도입의 어려움으로 인해 되었습니다. 이 연구에서 우리가 개발을 효율적으로 PDX 파생 CRC organoid 셀 받는 쥐로 주입에 앞서 3D 문화에 GFP lentivirus transduce 매우 민감한 탐지를 허용 하는 프로토콜의 스테레오-형광 현미경 검사 법, 고용 그들의 양식 micrometastases에 다른 장기 식민지
Protocol
Representative Results
Discussion
CRC PDX 모델 기본 종양의 성장 연구에 널리 고용은, 비록이 모델 인지 종양 전이 조사에 적용 또한 되지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다. 자연 스러운 전이 간, 다양 한 보고 콜론 PDX 모델4,10의 폐에서 거의 감지 했다. 높은 감도 가진 micrometastases를 감지, 우리는 GFP lentiviral 입자 PDX 파생 CRC organoids 그들의 orthotopic 받는 쥐로 정 맥 주사 이전에 시험?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 일 준 텐도 대학 영 탐정 수상 (2013, 2014, 2015) 요, 공동 프로젝트 수상 (2013 및 2014) K. M.에 의해 지원 되었다 고 교육, 문화, 스포츠, 과학에서 과학 연구에 대 한 원조를 부여 하 고 기술, 일본 (Y. K.을 16 K 15625 및 16 K 15598 밀리에). 우리는 특히 유용한 토론 및 기술 지원에 대 한 부의 Coloproctological 수술 및 분자 병 리의 모든 구성원에 게 감사입니다. 우리 또한 orthotopic 이식 마우스 및 박사에 대 한 수술 절차에 관대 한 기술 지도 대 한 박사 히로유키 곤노 (하 마마 츠 대학 학교 의학) 및 박사 히데키 기타지마 (국제 대학 보건 및 복지)을 감사합니다. 에 대 한 기술적인 조언 수행 종양 organoid 문화 요시타카 마 (치 바 암 센터)
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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