Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado
Summary
Para permitir la detección altamente sensible de lo cáncer colorrectal humano difundiendo células (CRC) colonizando los tejidos, aquí mostramos un protocolo para la transducción eficiente de partículas lentivirales proteína fluorescente verde (GFP) en células de organoides derivados de PDX CRC antes de su inyección en ratones receptores, con observación en el microscopio estéreo-fluorescencia.
Abstract
A pesar de avances en el tratamiento del cáncer colorrectal (CRC), muy pocas terapias radicales son efectivas para las etapas finales de la Convención. Para superar este desafío clínico, modelos de ratón tumores xenoinjerto usando muchos Ratón transgénico han desarrollado modelos con tumores y líneas celulares de carcinoma humano de larga trayectoria como modelos preclínicos. Parcialmente mímico las características de los carcinomas humanos, pero a menudo no recapitular los aspectos clave de las malignidades humanas incluyendo la invasión y metástasis. Por lo tanto, modelos alternativos que mejor representan la progresión maligna en el CCR humano han sido esperados durante mucho tiempo.
Mostramos en la presente generación de xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) mediante implantación subcutánea de pequeños fragmentos CRC disecados quirúrgico de un paciente. El colon PDXs desarrollar e histopathologically se asemejan a la CRC en el paciente. Sin embargo, pocos micrometástasis espontáneas son perceptibles en perfiles convencionales de afectados órganos distantes en el modelo PDX. Para facilitar la detección de diseminación metastásica a órganos distantes, extrae las células tumorales de organoide de las PDXs colon en cultura e infectados con lentivirus GFP antes de la inyección en altamente inmunodeficientes Shi/NOD-scid IL2Rγ null Ratones (NOG). Orthotopically inyectan derivados de PDX CRC organoide de células constantemente forma tumores primarios positivos para GFP en ratones receptores. Por otra parte, espontáneamente desarrollando micrometastásica colonias expresando GFP se detectan principalmente en los pulmones de los ratones por microscopía de fluorescencia. Por otra parte, intrasplenic inyección de CRC organoides con frecuencia produce colonización hepática. Tomados en conjunto, estos resultados indican GFP-labelled CRC derivados de PDX organoide células ser visualmente perceptible durante un proceso de varios pasos como la cascada de metástasis invasión. Los protocolos descritos incluyen el establecimiento de PDXs de CRC humana y cultura 3D de las celdas correspondientes de organoide CRC transduced por partículas lentivirales GFP.
Introduction
Cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muertes de cáncer en todo el mundo1. La insuficiente respuesta a las terapias convencionales de pacientes con enfermedad en estadio avanzado indica la ineficacia de los intentos de curar radicalmente CRCs. Para el desarrollo de enfoques terapéuticos más eficaces, se han establecido varios modelos de ratón preclínico de cáncer que imitan las características de la CRC. Varias líneas celulares CRC se han utilizado ampliamente para generar xenoinjertos tumorales debido a su comodidad y facilidad de manipulación. Cultura a largo plazo de líneas celulares de cáncer, sin embargo, a menudo provoca la selección de las poblaciones de célula única que son absolutamente proliferativa bajo una condición particular de la cultura, lo que resulta en resultados poco fiables y limitaciones cruciales en el preclínico de drogas desarrollo.
Sin ser cultivadas en vitro, xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) también se han generado por la implantación en modelos animales de tejidos humanos de CRC quirúrgicamente disecados de pacientes2,3,4. PDXs son ampliamente reconocidos como recapitula las principales características histopatológicas y alteraciones genéticas originalmente presentan en los tumores de los pacientes de los cuales fueron derivados. Por otra parte, organoides derivados del paciente tumor compuesto por células tumorales racimos fueron establecidos por la cultura en condiciones 3D que mímico de cerca las propiedades biológicas de los tumores originales5,6. También se aplicaron estos organoides de tumor para detección de drogas de alto rendimiento, lo que permite terapias personalizadas ser diseñado5. Sin embargo, marcadamente heterogénea población de CRC se asume para estar presente dentro de un tumor masa. Particular poblaciones de CRC pueden selectivamente proliferan y ampliar durante la serie en vivo y en vitro de pasajes de organoides PDX y tumor, respectivamente. Esto puede permitir también los perfiles de expresión génica global y estado epi/genética de lo CRC afectado al cambio, lo que resulta en un mínimo parecido con el CRC parental.
CRC organoides derivados del paciente y los extraídos de colon humano benigno dirigido al puerto de combinaciones de mutaciones oncogénicas también han sido empleados para investigar las características distintivas de las células tumorales humanas ejemplificadas por la invasión tumoral y metástasis 6,7,8,9. Sin embargo, la muy baja incidencia de metástasis espontánea que surjan de implantación ortotópica de CRC derivados del paciente en ratones inmunodeficientes, ha hecho más difícil estudiar el proceso de varios pasos de la cascada de metástasis invasión que incluye local invasión, intravasación, transporte en el torrente sanguíneo, la extravasación y la colonización de órganos distantes4,10. Micrometástasis como representaron por la deposición de células de tumor ≤2 mm, forman por organoides derivados del paciente de la CRC, a menudo pasado por alto en el análisis histopatológico de las secciones de órganos distantes afectadas en modelos experimentales de ratón. Visualización de micrometástasis espontánea también ha sido mínima en vivo debido a la dificultad de introducir eficientemente marcadores fluorescentes en las células del tumor organoide antes de su inyección en ratones receptores. En este estudio, hemos desarrollado un protocolo para transducir eficazmente lentivirus GFP en células de organoides derivados de PDX CRC en 3D cultura antes de la inyección en ratones receptores y para permitir la detección altamente sensible, empleando microscopía de fluorescencia de estéreo de su colonización de los diferentes órganos en forma de micrometástasis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el modelo PDX CRC ha sido ampliamente empleado para estudiar el crecimiento del tumor primario, si este modelo es también aplicable a la investigación de metástasis del tumor ha no aún se han aclarado completamente. Metástasis espontáneas también fueron apenas detectables en el hígado y los pulmones de varios divulgados colon PDX modelos4,10. Para detectar micrometástasis con alta sensibilidad, hemos desarrollado un protocolo para la transducción…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Juntendo University investigador premio joven (2013, 2014 y 2015) años, el Premio de proyecto conjunto (2013 y 2014) a M. K. y convocatoria de ayudas para la investigación científica desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y Tecnología, Japón (16 15625 K a K. Y. y 16K 15598 a M.G.). Estamos especialmente agradecidos a todos los miembros del Dpto. de cirugía Coloproctological y Patología Molecular para discusiones útiles y soporte técnico. También agradecemos Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) y el Dr. Hideki Kitajima (Universidad Internacional de salud y bienestar) generosa orientación técnica en los procedimientos quirúrgicos para la implantación ortotópica en ratones y Dr. Yoshitaka Hippo (centro del cáncer Chiba) para asesoramiento técnico sobre la realización de la cultura de organoide de tumor.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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