Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti
Summary
Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.
Abstract
İnsan kolorektal kanser (CRC) tedavisinde güncel gelişmeler rağmen birkaç radikal tedaviler CRC geç aşamaları için etkilidir. Klinik bu meydan okuma, tümör xenograft fare modelleri köklü insan Karsinomu Hücre satırları ve birçok transgenik fare modelleri tümörleri ile geliştirilen preklinik model olarak kullanarak aşmak için. Onlar kısmen insan karsinomlar özelliklerini taklit ama çoğu insan maligniteler işgali ve metastaz dahil olmak üzere önemli yönleri özetlemek başarısız. Böylece, daha iyi insan CRC malign ilerlemesinde temsil alternatif modeller uzun zamandır beklenen.
Burada cerrahi bir hasta disseke küçük CRC parçaları subkutan implantasyonu tarafından hasta kaynaklı tümör xenografts (PDXs) nesil göster. İki nokta üst üste PDXs geliştirmek ve histopathologically hastada CRC benzer. Ancak, birkaç spontan micrometastases etkilenen uzak organlara PDX modelindeki geleneksel kesit tespit vardır. Uzak organlara içine metastatik yayma algılama kolaylaştırmak için iki nokta üst üste PDXs kültür tümör organoid hücreleri elde ve onları GFP lentivirus önce son derece immünyetmezligi NOD/Shi-scid IL2Rγ içine enjeksiyon ile enfektenull (Takoz) fareler. Orthotopically enjekte PDX kaynaklı CRC organoid sürekli olarak alıcı farelerde GFP için formu birincil tümörleri pozitif hücreleri. Ayrıca, kendiliğinden GFP ifade kolonileri özellikle bu fareler akciğerlerde floresans mikroskobu tarafından algılanan micrometastatic geliştirmek. Ayrıca, CRC organoids intrasplenic enjeksiyon sık hepatik kolonizasyon üretir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular PDX kaynaklı CRC organoid hücreleri GFP etiketli bir multistep işlemi sırasında görsel olarak algılanabilir olmak işgal-metastaz art arda sıralı olarak adlandırdığı göstermektedir. Açıklanan iletişim kuralları insan CRC PDXs ve 3D kültür GFP lentiviral moleküller tarafından transduced karşılık gelen CRC organoid hücre kurulmasını içerir.
Introduction
Kolorektal kanser (CRC) Kanser ölümleri dünya çapında1ikinci önde gelen nedenidir. İleri evre hastalığı olan hastaların konvansiyonel tedaviler için yetersiz yanıt bloklarındaki radikal tedavi girişimlerine etkisizliği gösterir. Daha etkili tedavi yaklaşımları geliştirmek için bloklarındaki özelliklerini taklit çeşitli preklinik fare modelleri kanser kurulmuştur. Çeşitli CRC hücre satırlarını tümör xenografts kolaylık ve işleme kolaylığı nedeniyle oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücre hatları, uzun vadeli kültür ancak, sık sık güvenilmez sonuçlar ve preklinik ilaç çok önemli sınırlamalar böylece sonuçlanan belirli kültür koşul altında oldukça proliferatif benzersiz hücre popülasyonlarının yelpazesi neden oluyor geliştirme.
Kültürlü vitroolmadan, hasta kaynaklı tümör xenografts (PDXs) da implantasyon insan CRC dokuların cerrahi hastaların2,3,4den disseke hayvan modelleri içine tarafından üretilmedi. PDXs yaygın olarak histopatolojik özellikler recapitulating olarak tanınan ve genetik değişiklikler aslında içinde hangi onlar elde hastalarda tümör mevcut. Ayrıca, hastanın kaynaklı tümör organoids tümör hücre kümeleri kültür yakından orijinal tümör5,6biyolojik özelliklerini taklit 3D koşullar altında tarafından kuruldu oluşur. Bu tümör organoids de böylece kişiselleştirilmiş tedaviler tasarlanmış5olmak izin veren yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için uygulandı. Ancak, belirgin heterojen CRC nüfus içinde tümör mevcut olduğu varsayılır kitle. Belirli CRC nüfus seçmeli olarak çoğalırlar ve PDX ve tümör organoids, pasajlar içinde vivo ve in vitro dizi sırasında sırasıyla genişletmek olabilir. Bu da genel gen ifade profilleri ve epi/genetik durumunu değiştirmek için etkilenen bloklarındaki böylece ebeveyn CRC için çok az benzerlik sonuçlanan izin verebilir.
Hasta kaynaklı CRC organoids ve bu oncogenic mutasyonlar kombinasyonları da insan tümör hücrelerinin tümör işgali ve metastaz tarafından örneği işaretlerinden araştırmak için istihdam edilmiştir liman için tasarlanmış noncancerous insan kolon elde 6,7,8,9. Ancak, hasta kaynaklı CRC orthotopic implantasyonu immünyetmezligi fareler doğan spontan metastaz insidansı çok düşük yaptı içerir işgalinden metastaz art arda sıralı multistep sürecinin çalışmaya zor yerel işgal, intravasation, kan dolaşımına, ekstravazasyonu ve uzak organlara4,10kolonizasyon taşıma. Micrometastasis olarak tümör hücresi birikimi ≤2 mm tarafından temsil edilen, hasta kaynaklı CRC organoids tarafından kurulan, genellikle histopatolojik Analizi deneysel fare modelleri etkilenen uzak organlara bölümleri gözden. Spontan micrometastases görselleştirme da en az vivo verimli bir şekilde alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce tümör organoid hücreye floresan işaretleri tanıtımı zorluğu nedeniyle olmuştur. Bu çalışmada, verimli bir şekilde PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere alıcı fareler içine enjeksiyon önce 3D kültüründe GFP lentivirus transduce ve son derece hassas algılama, izin vermek için bir iletişim kuralı, stereo-floresans mikroskobu, istihdam geliştirdiğimiz onların formu micrometastases için farklı organları kolonizasyon.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRC PDX modeli yaygın olarak birincil tümör büyüme çalışmaya istihdam edilmiş olsa da, bu model de tümör metastazı soruşturma için uygulanabilir olup olmadığı henüz tam aydınlatılmamıştır değil. Spontan Metastazlari ancak algılanabilir karaciğer ve akciğer çeşitli bildirilen iki nokta üst üste PDX modelleri4,10‘ da vardı. Micrometastases ile yüksek hassasiyet algılamak için PDX kaynaklı CRC organoids önce kendi orthotopic ve ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Juntendo Üniversitesi genç araştırmacı Ödülü (2013, 2014 ve 2015) yaşında, ortak proje Ödülü (2013 ve 2014) K. M. tarafından desteklenen ve Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim bilimsel araştırma için yardım verir ve Teknolojisi, Japonya (Y. K. için 16K 15625 ve M.G. için 16K 15598). Özellikle Coloproctological cerrahi bölümü ve moleküler patoloji tüm üyelerine yararlı tartışmalar ve teknik destek için minnettar olduğumuzu. Biz Ayrıca Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Üniversitesi bildirmektenmutluluk tıp) ve Dr. Hideki Kitajima (Uluslararası Üniversitesi Sağlık ve refah) cerrahi fareler ve Dr orthotopic implantasyon için cömert teknik yardım için teşekkür ederiz. Yoshitaka su aygırı (Chiba Kanser Merkezi) tümör organoid kültür yapılması hakkında teknik danışmanlık için.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
