Summary
Kromatin looping spelar en betydande roll i genreglering; Det har dock inga tekniska framsteg som möjliggör selektiv och reversibel modifiering av kromatin loopar. Här beskriver vi ett kraftfullt system för kromatin loop re-organization använder CRISPR-dCas9 (CLOuD9), visat att selektivt och reversibelt modulera genuttryck på riktade loci.
Abstract
Nyligen genomförda studier har tydligt visat att långväga, tredimensionell kromatin looping interaktioner spelar en betydande roll i reglering av genuttryck, men huruvida looping ansvarar för eller en följd av förändringar i genuttryck är fortfarande okänd. Tills nyligen, hur kromatin looping påverkar regleringen av genen aktivitet och cellulär funktion har varit relativt tvetydiga och begränsningar i befintliga metoder för att manipulera dessa strukturer förhindrat djupgående utforskning av dessa interaktioner. Lös denna osäkerhet, konstruerade vi en metod för selektiv och reversibel kromatin loop re-organization använder CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamiken i CLOuD9 systemet har påvisats genom framgångsrik lokalisering CLOuD9 konstruktioner att rikta genomisk loci för att modulera lokala kromatin konformation. Ännu viktigare, har också förmågan att vända den inducerade kontakten och återställa endogena kromatin konformation bekräftats. Modulering av genuttryck med denna metod fastställer kapacitet att reglera cellulära genuttryck och understryker den stora potentialen för tillämpningar av denna teknik att skapa stabila de novo kromatin loopar som markant påverkar gen uttryck i sammanhang av cancer och utveckling.
Introduction
Förhållandet mellan kromatin vikning i kärnan och den specifika organisationen av genomet har rönt stort intresse under de senaste åren som det har visat sig vara nära förknippad med gene expression1,2. Medan exakt förhållandet mellan gen aktivitet och modulering av kromatinstruktur förblir oklart, det har varit en hypotes om att samspelet mellan kromosomala kontakter till följd av dynamisk tredimensionell kromatin organisationen tjänar en gen reglerande funktion3. Faktiskt har en sådan effekt påvisats väl på det mänskliga globinzinkinsulin gen locus, där regionen locus kontroll (LCR) reglerar aktiviteten av generna globinzinkinsulin utvecklingsmässigt specifikt genom att skapa en kromatin slinga mellan de två regioner4. I både denna och andra regioner är det dock oklart huruvida kromatin looping är en orsak eller följd av förändringar i genuttryck.
Tills nu förblivit utmaningarna i att studera detta fenomen olöst. Till exempel engagerad andra försök att förmå kromatin loopar ändra linjära DNA-sekvens eller komplicerade förfaranden som kräver ett överflöd av bakgrundskunskap på specifika element som underlättar looping5,6, 7,8. Dessutom, medan tidigare arbete har föreslagit att kromatin loopar bilresa genuttryck i specifika och begränsade sammanhang7,är8, den nivå vid vilken kromatin looping påverkar transkriptionen globalt osäkert. Även om intresset för effekterna av långväga looping på genuttryck har växt kontinuerligt under de senaste åren har kvarstår obesvarade frågor kring upprättande och behålla kromatin kontakter om du vill ändra gen verksamhet.
Den teknik som vi har konstruerat sysselsätter nuclease bristfällig klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) - CRISPR - associerade protein 9 (dCas9), som möjliggör i stort sett gäller inriktningen av någon genomisk loci9. Denna teknik eliminerar de komplexa frågor som rör ändringar av den linjära DNA-sekvensen och är tillgänglig utan betydande kunskaper om särskilda looping komponenter. Framför allt, är verktyget universella och allmänt tillämpliga kromatin öglor redovisas i utvecklingen samt i en mängd sjukdomar, såsom cancer. Kraften i CLOuD9 demonstreras genom att reversibelt förändra strukturen för loopar att effektivt modulera genuttryck.
Protocol
1. gärna Design
- Välj en standard gärna designverktyg för att designa guiden RNAs10. Använda kompletterande par av tidigare utvecklade CLOuD9 konstruktioner9 (dvs. minst 1 S. aureus (CSA) och 1 S. pyogenes (CSP) konstruera) för varje experiment.
- Inom det valda online-designverktyget, använda Protospacer angränsande motiv (PAM) sekvens ”NGG” med en guide längd 20 bp för CSP och PAM sekvens ”NNGRRT” med en guide längd 21 för CSA.
- Välja guider baserat på specificitet Poäng och design guider på båda delarna för att maximera chanserna att få en fungerande guide.
- Beställ 2 oligonukleotider per guide från en oligo-tillverkare: för den framåt oligo, lägga ”caccg” till 5' slutet av sekvensen guide, och för den omvända oligo, lägga ”aaac” till 5' slutet och ”c” till 3' slutet innan du beställer.
- Inledningsvis, design 3-5 gRNAs för varje region av intresse, spridda över en 250-1000 bp region. Bedöma den gärna inriktning effektivitet enligt följande:
- Klon identifierade gRNAs in i en aktiv Cas9 plasmid (se steg 3) och övergående transfect i 293T celler (se steg 4)11.
- Odla cellerna för 2-3 d i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (penna strep), och sedan skörda och extrahera genomisk DNA12.
- Förstärka riktade regioner av polymeras-kedjereaktion (PCR). Kör produkter på en 1,5% agarosgel och rena lämpligt band.
- Utför en T7 Amiiiiin analysen som beskrivs i Guschin, et al. protokoll13,14.
Obs: Effektiv guider är de fast beslutna att klippa DNA på målwebbplatsen.
2. cellkultur
- Upprätthålla celler i ett hälsosamt och aktivt delar staten.
- För K562s, kultur i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media med 10% FBS och 1% penna strep.
- Odla K562s i en 25 cm2 snedställda hals kolv för underhåll och justera cell densiteten till 400 000 celler per mL varje dag.
- Efter K562s har varit sensorik med CLOuD9 konstruerar, tillsätt 2 µg/mL puromycin och 100 µg/mL hygromycin till underhållsmassmedia.
- För 293Ts, kultur i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS och 1% penna strep.
- Odla 293Ts i 10 cm2 plattor och delas när konfluenta.
- För K562s, kultur i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media med 10% FBS och 1% penna strep.
3. plasmid förberedelse och gärna införande15
Obs: Plasmid kartor finns i appendix och primers som utnyttjas i experiment som exempel finns i kompletterande Tabell1.
- Blanda 5 µg lentiviral CRISPR plasmiden med 3 µL av BsmBI, 3 µL av alkaliskt fosfatas, 6 µL 10 x buffert och 0.6 µL av nylagade 100 mM DTT. Ta den totala volymen till 60 µL med ddH2O och inkubera vid 37 ° C i 30 min att smälta och dephosphorylate Plasmiden.
- Gel rena smält plasmiden och eluera i ddH2O.
- Blanda 1 µL av varje av de parkopplade guiderna vid 100 µM med 1 µL 10 x 0,5 µL T4 Ligation buffert och 6,5 µL av ddH2O T4 PNK, att nå 10 µL totala volym. Inkubera vid 37 ° C i 30 min, sedan 95 ° C i 5 min, sedan ramp ner till 25 ° C vid 5 ° C/min.
Obs: Detta kommer att glödga para av guider. - Späd den glödgade guider (från steg 3.3) 1: 200 i ddH2O.
- Blanda 1 µL av smält plasmiden från steg 3,2 med 0,5 µL utspädda ligated guider från steg 3,4 2,5 µL av 2 x buffert, 1 µl ddH2O och 0,5 µL av Ligase, att göra en 5,5 µL totala reaktion. Odla detta i rumstemperatur i ca 10 min att ligera guider till BsmBI rötas Plasmiden.
- Förvandla den nyligen ligated plasmiden från steg 3.5 till Stbl3 bakterier och förstärka med någon plasmid förberedelse metod.
4. lentivirus produktion
- Räkna 750.000 293T celler per brunn för en sex-väl plåt med hjälp av en hemocytometer och utsäde dem i DMEM med 10% FBS och 1% penna strep. Använd en väl för varje konstruktion.
- 24 h efter sådd, ändra media till färska antibiotikum-fri DMEM med 10% FBS.
- I en tub, späd 11 µL av lipid-baserade transfection reagens med 150 µL av OptiMEM medium, per reaktion11.
- I en separat slang, späd 2 µg av CLOuD9 lentiviral vector plasmiden från steg 3.6, 0,35 µg pMDLg/pRRE, 1 µg av pRSV-Rev och 0,65 µg av pMD2.G med 150 µL av OptiMEM medium, per reaktion11.
- För varje reaktion, lägga de utspädda lentiviral plasmid blandningarna till utspädda lipid-baserade transfection reagenset i förhållandet 1:1, och inkubera i 5 min11.
- Lägga till hela volymen av varje blandad komplex från 4,5 steg i respektive brunnar av antibiotikum-fri 293T celler från steg 4,2.
- 48 h senare, samla viral produktion media genom pipett till en färsk tub och spinn ner vid 300 x g i 5 min. Efter centrifugering, flytta supernatanten till en färsk röret ta bort kvarvarande cellfragment.
- Använda viral produktion media omedelbart för transduktion av målceller eller frysa vid-80 ° C för framtida bruk.
5. lentivirus transduktion celler
- Tillsätt 250 µL av varje viral konstruktion av intresse (består av kompletterande CLOuD9 plasmider) i en 15 mL koniska rör som innehåller 80 000 celler för CLOuD9 tillämpning.
- Ta den totala volymen av media i varje konisk 1 ml med antibiotika-fria medier, och lägga till polybrene till en slutlig koncentration mellan 1-8 µg/mL (den högsta koncentrationen av polybrene tolereras av den celltyp som utnyttjas måste bestämmas experimentellt).
- Celler vid 800 x g i 30 min i rumstemperatur och sedan Omsuspendera genom pipettering utan att ta bort viral supernatanten. Flytta hela cellsuspensionen till en cell kultur plattan.
- 24 h efter transduktion, spin celler ner vid 300 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Aspirera viral supernatanten och återsuspendera cellerna i regelbunden cell kultur media.
- Lägg till puromycin (1 µg/mL för 293T celler) och hygromycin (25 µg/mL för 293T celler) till den cellodlingsmedium välja för dubbelt sensorik celler på nästa dag. Experimentellt bestämma lämpliga koncentrationerna av puromycin och hygromycin för en viss celltyp före början experimenten.
- Bevara celler i Val av media för minst 3 d innan några nedströms experiment och hålla i Val av media för varaktigheten av alla experiment.
6. cell Dimerization och Wash-Out
- Lägg till 1 mM Abscisic syra (ABA) eller en likvärdig mängd av dimetyl sulfoxid (DMSO) kontroller cellkultur att dimerize CLOuD9 valt och sensorik celler. Använd ABA inom 6 månader från mottagandet, hålla kall och skydda den från ljus i hela användningen. 2 mM ABA kan utnyttjas om det behövs.
- Ändra media dagligen för att tillhandahålla färska ABA (eller DMSO för kontroller) för varaktigheten av experimenten.
Obs: Ingen gräns för längden på dimerization har ännu observerats.
- Ändra media dagligen för att tillhandahålla färska ABA (eller DMSO för kontroller) för varaktigheten av experimenten.
- Omvänd dimerization genom avlägsnande av media som innehåller ABA och tvätta cellerna med tillräckligt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) att täcka ytan av plattan, två gånger. Därefter odla celler i ABA-fria medier att upprätthålla ett un-dimerized tillstånd.
7. Immunoprecipitation och Co-immunoprecipitations
Obs: Se alla buffertar färska och omedelbart före användning.
- Efter avslutad dimerization experiment, samla och snurra ner cellerna och sug ut supernatant.
- Crosslink och frysa ner celler
- Göra en fräsch lager av 1% formaldehyd i PBS vid rumstemperatur med färskt material. För varje 2 miljoner celler, försiktigt blandas med 1 mL 1% formaldehyd vid rumstemperatur för exakt 10 min, medan roterande.
Obs: Använd en minsta volym på 10 mL för crosslinking mindre än 10 miljoner celler. - Släcka crosslinking med tillägg av glycin till en slutlig koncentration av 0,125 M, följt av inkubering under 5 minuter i rumstemperatur, medan roterande.
- Snurra ner cellerna och tvätta 1-2 x med iskall PBS. Cell pellets kan snapin fryst i flytande kväve och lagras vid-80 ° C eller används omedelbart.
Obs: Värme kommer att återföra formaldehyd antipyridinantikropp. Om rusade, kan celler lagras direkt i-80 ° C utan fäst frysa.
- Göra en fräsch lager av 1% formaldehyd i PBS vid rumstemperatur med färskt material. För varje 2 miljoner celler, försiktigt blandas med 1 mL 1% formaldehyd vid rumstemperatur för exakt 10 min, medan roterande.
- Förbereda antikropp/pärla konjugat
Obs: Optimera förutsättningarna för valda antikropp (dvs, testa olika lysis buffertar för cellen lysis och utför IP) kan vara värt. Två vanliga buffertar, Farnham lyseringsbuffert och modifierade RIPA bufferten, kan ha en betydande effekt på IP effektivitet och ultraljudsbehandling effektivitet. Alla buffert kompositioner kan hittas i Tabellen för material. Dessutom, Tänk på att kromatin ultraljudsbehandling kan ta flera timmar att slutföra.- Återsuspendera pärlor av vortexa kort som passar den valda antikroppen.
- Överför en lämplig mängd pärlor för försöket till en 1,5 mL tub. Som utgångspunkt, Använd 20 µL av pärlor för varje 1 µg av antikropp. Lägg inte antikropp ännu.
Obs: Använd 10 µg antikropp med 200 µL av pärlor för 1 mg totalt lysat som utgångspunkt, om det är känt att antikroppen är mer eller mindre effektiv än detta skulle innebära. För låg överflöd proteiner, kan detta förhållande behöva justeras. - Om du använder Farnham lyseringsbuffert, tvätta 3 x i IP förtunningsbuffert. Om du använder RIPA lyseringsbuffert, tvätta 3 x i RIPA lyseringsbuffert.
- Återsuspendera pärlor i en slutlig volym av samma bufferten från steg 7.3.3 (IP utspädning eller RIPA bufferten) som är > 1 x och < 5 x den ursprungliga volymen. dvs. För 100 µL inledande pärla volym, använda mellan 100 och 500 µL slutliga resuspension volym.
- Lägga till antikropp tvättas pärlor nu på en lämplig koncentration. För en bra HA eller flagga antikropp till IP CLOuD9 konstruktioner, använda antikroppar vid 1:50 (µg protein: µg protein lysate) och inkubera mellan 8 + h och övernattning på 4 ° C, medan roterande. Alternativt, inkubera i 2-4 h i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten från pärlor och kassera.
- Tvätta pärlor 3 x med tvättlösning.
- Blandas i en minimal volym på den buffert som utnyttjas för natten inkubation med antikroppen (IP utspädning eller RIPA bufferten). Förvara kallt tills kombinerat med protein lysate.
- Sonikera kromatin
- Först lysera celler med tillägg av svullnad buffert till cell pellets på is i 10 min, snärta celler varje några minuter att lösa.
Obs: Generellt 500 µL av svullnad buffert tillsätts 25 miljoner celler och skalas därifrån, men gör inte använda mindre än 500 µL buffert för < 25 miljoner celler. - Dounce manuellt både medurs och moturs, 13 x varje.
- Sedan spin atomkärnor ner vid 4 ° C för 5 min vid 1500 x g. Aspirera supernatanten helt och upprepa för att ta bort återstående supernatanten, sedan väga cellpelleten i mg.
- Lägga till proteashämmare i atomkärnor lyseringsbuffert (Farnham buffert eller RIPA buffert, ovan, välja en).
- Lägga till 10 x mängd kärnor lyseringsbuffert till pelleterat kärnor att resuspendera (exempelvis tillsätt 1 mL av atomkärnor lyseringsbuffert till en 0,100 g pellets). Kort vortex och lyse i 10 min på is.
Obs: Tänk på storleken av ultraljudsbehandling röret. Perfekt volym är ofta < 1 mL, så prover kan behöva delas om pellets är mycket stora.- Co-IP, Sonikera atomkärnor kort för att solubilize material och släcka SDS till en nivå som tillåter immunoprecipitation med 2-3 volymdelar förtunningsbuffert och sedan fortsätta till steg 7.4.6. För mycket känsliga antikroppar, lägga till fler förtunningsbuffert för att ytterligare minska koncentrationen av SDS.
Obs: Stoppa ultraljudsbehandling när lysate rensar; det ändras från en ogenomskinlig/genomskinlig vit till helt transparent. Hålla prover så kallt som möjligt och inte över Sonikera. - För ChIP, grundligt Sonikera DNA för att få 150-1000 bp DNA-fragment, sedan gå vidare till steg 7.4.6.
- Co-IP, Sonikera atomkärnor kort för att solubilize material och släcka SDS till en nivå som tillåter immunoprecipitation med 2-3 volymdelar förtunningsbuffert och sedan fortsätta till steg 7.4.6. För mycket känsliga antikroppar, lägga till fler förtunningsbuffert för att ytterligare minska koncentrationen av SDS.
- Snurra ut olösligt material med maximal hastighet för 10 min vid 4 ° C.
- Överföra lösliga material till en ny tub.
- För Co-IP, mätning av koncentrationen av protein och gå till rullgardinsmenyn i steg 7,5.
- För ChIP, ta bort en 10 µL alikvot av avmarkerad lysate och lägga till 40 µL IP eluering buffert och 6 µL 5 M NaCl som totalt 56ul. Koka i 15 min vid 95 ° C, tillsätt 5-10 µL av 3 M NaOAc pH 5 och städa upp på en PCR-rening kolumn. Mätning av koncentrationen av DNA genom att mäta absorbansen vid 260 nm och standardisera i prover. Fortsätt sedan med pulldown i steg 7,5.
Obs: Extra lysate kan snapin fryst vid-80 ° C och användas vid ett senare tillfälle, men bästa resultat erhålls från färska lysate. Om frysning, inte frysas och tinas lysate mer än en gång.
- Först lysera celler med tillägg av svullnad buffert till cell pellets på is i 10 min, snärta celler varje några minuter att lösa.
- PULLDOWN
- Överför en lämplig mängd protein lysate till en frisk slang. Om du använder Farnham lyseringsbuffert, späd i 2.1 volymer IP förtunningsbuffert (ovan).
- Ställ undan 100 µL av supernatanten för Inspelningsvolym, och förvaras vid 4 ° C tills nästa dag.
- Lägg pärla/antikropp konjugat från steg 7.3.8 i prover nu.
- Rotera prover vid 4 ° C över natten och se till att det finns tillräckligt med volym för flytande rörelse i 1,5 mL rör.
- Tvätta och eluera
- Efter övernattning rotation, spara supernatanten som den icke-bindande fraktionen. Sedan pärlor tvätta 3-5 x i IP förtunningsbuffert.
- Förbereda IP eluering buffert vid rumstemperatur, utan hämmare.
- Eluera komplex med 50 µL eluering buffert skakas på en virvel vid 67 ° C för 15 min. Transfer eluering till en ny tub och upprepa med ytterligare 50 µL. kombinera dem båda för en total 100 µL eluering.
Obs: Om det finns för mycket bakgrund från proceduren eluering, värme kan vara minskas eller elimineras under skakning/inkubation. Detta generellt minskar avkastningen av målprotein men minskar betydligt bakgrunden.
- Omvänd antipyridinantikropp genom uppvärmning vid 67 ° C för > 4 h.
Obs: Detta är inte absolut nödvändigt för samtidig IPs men kan vara till hjälp.- För Co-IP, för att säkerställa full dimerization mellan målen i intresse, köra eluat på en SDS-page gel och sonden med antikroppar mot HA taggen eller flagga tagg, som anges, alla på 1:1000. Fortsätt sedan till steg 8.
- För ChIP-qPCR, för att säkerställa korrekt lokalisering och inriktning av varje CRISPR-dCas9 komponent, rengör eluering produkt på en kolumn och eluera i 10 µL. utför realtid kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) av renade DNA. Primers utnyttjas i presenterade uppgifter finns i kompletterande Tabell1. Fortsätt sedan till steg 8.
8. RNA-extraktion och kvantitativ PCR
- För att undersöka CLOuD9-inducerade förändringar i genuttryck, först isolera och rena total-RNA från både kontroll cell pellets och dimerized cell pellets.
- Gör kompletterande DNA (cDNA) från renat RNA genom omvänd Transkription17 och utföra qPCR analyser. Primers finns i kompletterande Tabell1.
9. kromosom konformation fånga Assay
- Att iaktta förändringar i frekvens av genomisk loci kontakter induceras av CLOuD9, utföra kromosom konformation capture (3C) analyser8.
- Kvantifiera 3C ligering produkter i två uppsättningar av dubbletter för varje tre biologiska replikat av kvantitativ realtids-PCR. Normalisera prover på 3C signaler från det tubulin locus. Primers finns i kompletterande Tabell1.
Representative Results
CLOuD9 inducerar reversibel β-globin arrangören-LCR looping. Lämplig användning av CLOuD9 systemet inducerar vändbar kontakt av kompletterande CSA och CSP CLOuD9 konstruerar genom tillägg eller borttagning av ABA till cell kultur media (figur 1a). CSA och CSP konstruktioner (figur 1b) är lokaliserade till lämpliga genomisk regioner använder standard CRISPR gRNAs. Med tanke på den stora dokumentationen av det mänskliga globinzinkinsulin locus samt täta kromosomala vikning och ombildning som inträffar det under utveckling, valdes denna region att påvisa nyttan av CLOuD9 systemet. Dessutom valdes K562 cell linjen eftersom det har visats att konsekvent uttrycka höga nivåer av den fetala γ-globingenen, i motsats till den β-globingenen som uttrycks vanligtvis i friska vuxna erytroid härstamning celler. Med hjälp av K562 celler, kan CLOuD9 förmåga att ändra genuttryck undersökas genom att försöka återställa uttryck för den β-globingenen i denna cellinje.
Före induktion av dimerization, kromatin immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR) utnyttjades för att säkerställa korrekt lokalisering och inriktning av varje CLOuD9 komponent (kompletterande figur1). Dessutom, verifierade co-immunoprecipitation (Co-IP) med och utan ABA CSA och CSP dimerization i närvaro av den ligand samt reversibilitet i avsaknad av liganden (figur 1 c och kompletterande figur 2). 24 h efter att lägga till ABA, större kontakt mellan β-globin och LCR visades mätt med kromosomen konformation capture (3C) i cellerna med båda dimerization delar, men inte de kontroller som innehåller endast två CSA eller CSP konstruktioner, alltså validera den Specificiteten av kromatin ändringen för de rikta webbplatser (figur 1 c och kompletterande siffrorna 3,4). Att skapa LCR-β-globin interaktionen helt eliminera inte den endogena LCR-globin-kontakten, men i stället läggs till den ursprungliga kontakten, som tidigare rapporterats8. För upp till 72 h dimerization, oavsett den exakta regionen inom riktade LCR och β-globin promotor regionen (kompletterande siffror 5,6) observerades förhöjningar β-globin/LCR kontakter. Slutligen bekräftades reversibiliteten av systemet med 3C efter borttagning av ABA, som visade en fullständig förnyelse av endogena konformation (figur 1 d och kompletterande siffrorna 3-6).
Vi ansåg att den framgång som visas i cellerna K562 kan vara ett resultat av globinzinkinsulin locus placering i en region euchromatin (figur 1 d), så en andra cellinje utnyttjades för att utforska denna idé. CLOuD9 systemet tillämpades på HEK 293T celler i regioner som är heterochromatic och inte uttrycker globinzinkinsulin gener (figur 1e). Resultatet liknade vad som observerades i K562s; Mer β-globin LCR föreningar mättes av 3C efter 24 h med ABA (figur 1e och kompletterande figur 3), som tillhandahåller bevis för CLOuD9's robust förmåga att fungera i olika cellulära miljöer, trots det ursprungliga kromatin-tillståndet eller konformation.
Ytterligare lokus testades för att säkerställa bred tillämpligheten av CLOuD9, inklusive Oct4 promotorn och en distala 5' förstärkare i 293T celler. Tidigare har varit det inga detekterbara Oct4 uttryck i denna cellinje och dessutom inga endogena kontakter som beskrivs. Bevis på Oct4 uttryck i embryonala stamceller som följd av kontakt med den distala 5' förstärkare motiverade detta experiment, och samma resultat observerades vid β-globin locus18. Kontakt mellan Oct4 distala enhancer och arrangören identifierades i CLOuD9 aktiverade celler, men inte kontroll cellerna (figur 1f). Dessutom konstaterades det att den Oct4 promotorn och distala 5' enhancer växelverkan också uppmanas en 3' förstärkare att kontakta arrangören Oct4. Denna händelse är förenlig med bevis att den 3' förstärkare interagerar med Oct4 arrangören/5 ' distala enhancer komplexa under endogena gen aktiveringen10.
CLOuD9 inducerar sammanhang specifika förändringar på genen loci. Efter att ha bekräftat att CLOuD9 systemet verkligen inducerar kromosomala kontakter på genen loci, försökte vi undersöka slingor effekt på genuttryck. Det har dokumenterats att transkription för globin och Oct4 gener är avhängiga av kontakterna mellan de LCR och globin gen loci och mellan distala 5' förstärkare och Oct4 promotorn, respektive1,11. Således hypotesen vi att använda den CLOuD9 system till drive kromatin loop bildas i alla dessa regioner skulle resultera i övertygande genuttryck.
I båda lokus, RT-qPCR visade att ABA inducerad kromatin loopar körde ökningar i Oct4 uttryck i 293T celler och i β-globin uttryck i K562 celler, men inte i 293Ts (figur 2a). Tillägg av ABA till cell kultur för så lite som 24 h ökade β-globin uttryck avsevärt, uttryck sig dock fortsatt att öka stadigt upp till 72 timmar och var reversibelt vid ABA blekt (figur 2a). Alla K562 celler förutom kontrollerna följt denna trend, oavsett om de dimerization komponenterna var belägen i LCR och β-globin arrangören regionerna (figur 2a och kompletterande siffror 7,8). Till stöd för dessa fynd motsvarade ChIP-qPCR av H3K4me3 och RNA Pol-II på det β-globin locus i K562s och 293Ts med observerade förändringar i transkription (figur 2 c-f).
CLOuD9 upprättar stabil kromatin loopar. Även om kortsiktiga loop induktion med CLOuD9 klart följt förväntningar, om långsiktiga induktion av looping hade differentiella effekter återstod för att observeras. För att undersöka detta, odlades celler i närvaro av ABA i 10 dagar. Medan både K562s och 293Ts uppvisade ökad kontakt frekvens mellan det β-globin locus och LCR i förhållande till kontroller (figur 3a, b och kompletterande siffror 9,10), observerades förändringar i β-globin uttryck fortfarande bara i K562 celler (figur 3 c). Intressant, dock konstaterades att långsiktiga dimerization i K562s, där transkription var starkt uppreglerad, var ingen längre vändbar (figur 3a och kompletterande siffrorna 9-11). Dock inducerade i 293Ts, där ingen förändring i transkription observerades efter långsiktiga dimerization, förändringar i kromatin kontakter förblev reversibel (figur 3b och kompletterande diagram 9).
Sammantaget observerades endast en liten minskning av genuttryck efter 10 dagar av ABA avlägsnande, som varit betydligt högre än gen uttrycksnivåerna före dimerization (figur 3 c). I linje med detta, K562 celler, men inte 293T celler, visade ihållande förändringar i H3K4me3 och RNA Pol-II på det β-globin locus av ChIP-qPCR, jämfört med kontroller, även efter 10 dagar av ABA borttagning (figur 3d-f). Våra resultat tyder således att stabiliteten i kromatin slingan innebär mer hållbar genuttryck.
Figur 1: CLOuD9 inducerar reversibel β-globin arrangören-LCR looping. (a) tillägg av abscisic syra (ABA, grön) ger två kompletterande CLOuD9 konstruktioner (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), röd och blå, respektive) in närheten, remodeling kromatinstruktur. Borttagning av ABA återställer endogena kromatin konformation. (b) CLOuD9 konstruktioner kombinera CRISPR-dCas9 från S. aureus och S. pyogenes med reversibelt dimerizeable PYL1 och ABI1 domäner. (c) tidslinje av CLOuD9 dimerization experiment. (d) 3 C assay mäta β-globin locus-wide crosslinking frekvenser i K562 celler efter 24 h behandling med ABA (röd) och efterföljande blekt (blå) visar reversibilitet inducerad β-globin/LCR kontakter (markerade i grått). Orange pilspetsar ange specifika CLOuD9 konstruera målregionerna. Mina fragmentet som innehåller överkänslighet platser 1-4 av LCR (svart fält) användes som regionen ankare. Dess crosslinking frekvens med andra angivna mina fragment (namn på toppen av diagrammet) bedömdes. Den mänskliga β-globin gener och LCR överkänslighet platser avbildas på undersidan av grafen med kromosomala positionskoordinater. Data från ChIP-seq av H3K4me3 och H3K9me3 visar att denna region är euchromatic i K562s. (e) liknande reversibla förändringar i kromatinstruktur ses i HEK 293T celler, trots bevis från H3K4me3 och H3K9me3 ChIP-seq data som globinzinkinsulin regionen är heterochromatic i denna celltyp. (f) 3 C analys mätning Oct4 locus-wide crosslinking frekvenser i 293T celler efter 72 h behandling med ABA (röd) visar inducerad Oct4/distala enhancer kontakter (markerade i grått). Orange pilspetsar ange specifika CLOuD9 konstruera målregionerna. MboI fragmentet som innehåller Oct4 arrangören (svart fält) användes som regionen ankare. Dess crosslinking frekvens med andra angivna MboI fragment (namn på toppen av diagrammet) bedömdes. De mänskliga Oct4 regionerna avbildas på undersidan av grafen med kromosomala positionskoordinater. Alla 3C resultat erhölls från minst tre oberoende experiment. 3C värden var normaliserade till tubulin. För β-globin sattes interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet till noll. För Oct4 sattes interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och en negativ kontroll fragment utanför regionen Oct4 samverkande till noll. Felstaplar visar s.d. n = 3. Denna siffra har ändrats från figur 1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: CLOuD9 inducerar sammanhang specifika förändringar i genen uttryck och kromatin tillstånd. (a) CLOuD9-inducerad kromatin looping β-globin locus resultaten i reversibel induktion av β-globin uttryck i K562s men inte i 293Ts. betydelse som ges i förhållande till kontroll behandlas celler. Tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0,0001, t = 10,42 df = 5; n.s. obetydlig. Felstaplar visar s.d. n = 3. (b) induktion av Oct4 uttryck observerades i 293Ts efter CLOuD9-inducerad slingor på det samma locus. Betydelse ges i förhållande till kontroll behandlas celler. Tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Felstaplar visar s.d. (c) Schematisk bild av ChIP-qPCR primer platser längs β-globin gen kroppen. (d, e) ChIP-qPCR visar reversibla förändringar i H3K4me3 på de β-globin locus i K562s men inte i 293Ts efter CLOuD9-inducerad looping. Tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Felstaplar visar s.d. (f) CLOuD9 medierad förändringar i β-globin transkription i K562s överensstämmer med ökningar i RNA Pol-II beläggning över helheten av β-globin gen kroppen. Tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Felstaplar visar s.d. Denna siffra har ändrats från figur 2 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: CLOuD9 upprättar stabil kromatin loopar som upprätthåller robusta genuttryck efter långsiktiga dimerization. (a, b) 3 C-analysen visar att i K562s men inte 293Ts, CLOuD9-inducerad kromatin looping blir oåterkallelig efter 10 dagar av ABA behandling, även när ABA avlägsnas för upp till 10 ytterligare dagar. Alla 3C resultat erhölls från minst tre oberoende experiment. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar s.d. n = 3. (c) Loop stabilisering i K562s resulterar i långlivade uttryck för β-globin, även efter 10 dagar av ABA blekt. Inga förändringar i β-globin uttryck kan observeras i 293Ts. betydelse som ges i förhållande till kontroll behandlas celler. Tvåsidiga Students t-test *** P < 0,0001, t = 5.963, df = 5; n.s. icke betydande (d) ChIP-qPCR visar ökningar H3K4me3 märken över det β-globin locus i svar till CLOuD9-inducerad looping upprätthålls efter 10 dagar av liganden blekt i K562s. tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. (e) inga betydande förändringar i H3K4me3 signalerar följande långsiktiga dimerization observerades av ChIP-qPCR i 293Ts. (f) ökade RNA Pol-II beläggning av de β-globin locus efter långsiktiga loop induktion bibehölls i K562s efter 10 dagar av liganden blekt. Tvåsidiga Students t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Alla felstaplar visar s.d. Denna siffra har ändrats från figur 3 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: CLOuD9 konstruktioner lokalisera deras avsedda målet regioner. Kromatin immunoprecipitation och kvantitativ PCR för CLOuD9 konstruktioner visar korrekt lokalisering till deras avsedda genomisk loci. Denna siffra har ändrats från kompletterande Figur1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: CLOuD9 konstruktioner reversibelt associera i ABA behandlingssvaret. Co-immunoprecipitations visar föreningen av dCas9 proteiner följande 72 h ABA behandling är omvända följande efterföljande 72 h av liganden blekt. Denna siffra har ändrats från kompletterande diagram 2 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: kontroll behandling framkallar inga förändringar i kromatin kontakter. Behandling med DMSO, en kontroll agent, för 24 timmar inducerar inga förändringar i endogena kromatin konformation av 3C i antingen K562 celler eller HEK 293Ts. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 3 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 4: kontroll CLOuD9 sensorik celler visar inga förändringar i kromatin looping. Styra två CLOuD9 konstruerar antingen LCR eller β-globin promotorn inducerar inga signifikanta förändringar i kromatinstrukturen av 3C efter ABA behandling i förhållande till kontroll behandling. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 4 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 5: CLOuD9 kromatin looping förblir reversibel efter 72 timmar av dimerization. 3C analys i K562s visar reversibilitet CLOuD9 inducerad β-globin/LCR kontakter efter 72 timmar ABA behandling. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 5 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 6: CLOuD9 inducerad β-globin/LCR looping inte påverkas av globinzinkinsulin målplatsen. Styra CSA och CSP konstruktioner till alternativa regioner i LCR eller β-globin arrangören resultaten i liknande reversibla förändringar i loop induktion av 3C efter 72 timmar ABA behandling. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande diagram 6 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 7: CLOuD9 inducerade förändringar i genuttryck upprätthålls oavsett globinzinkinsulin målplatsen. Styra CSA och CSP konstruerar till alternativa regioner i β-globin arrangören och LCR har ingen inverkan på induktion av genuttryck efter 72 h av dimerization. Men medan vissa påverka styrkan genuttryck följande långsiktiga (10 dag) dimerization observerades, var höga nivåer av β-globin i förhållande till kontroll behandlas celler ihållande följande efterföljande ligand blekt för 10 ytterligare dagar. Betydelse ges i förhållande till kontroll behandlas celler. p < 0,001, t = 10,25, df = 5; p < 0,0001, vänster till höger t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. obetydlig. Alla felstaplar visar SD. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 7 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 8: kontroll CLOuD9 sensorik celler visar inga förändringar i β-globin uttryck. Styra två CLOuD9 konstruerar antingen LCR eller β-globin promotorn inducerar inga signifikanta förändringar i β-globin uttryck efter ABA behandling i förhållande till kontroll behandling. Betydelse ges i förhållande till kontroll behandlas celler. n.s. obetydlig. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 8 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 9: långvarig kontroll behandling framkallar inga förändringar i kromatin kontakter. Behandling med DMSO, en kontroll agent, för 10 dagar inducerar ingen förändring av endogena kromatin konformation av 3C i antingen K562 celler eller HEK 293Ts. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 9 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 10: långsiktiga CLOuD9 inducerad β-globin/LCR looping inte påverkas av globinzinkinsulin målplatsen. Styra CSA och CSP konstruerar till alternativa regioner i LCR eller β-globin arrangören resultaten i ihållande likaså loop induktion som framgår av 3C efter 10 dagar av ABA behandling och 10 dagar för efterföljande ligand blekt. 3C värden var normaliserade till tubulin och interaktion frekvenser mellan ankare fragmentet och fragmentet som omfattar β/HS fragmentet sattes till noll. Felstaplar visar SD. n = 3. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 10 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 11: CLOuD9 konstruktioner irreversibelt associera svar på ABA långtidsbehandling. Co-immunoprecipitations visar irreversibel sammanslutning av CSA och CSP dCas9 proteinerna efter 10 dagar av ABA behandling och 10 efterföljande dagar av liganden blekt. Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 11 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande Tabell1: lista över primer sekvenser för gRNAs, qRT-PCR, 3C och ChIP qPCR. Den här tabellen har ändrats från kompletterande Tabell1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell
Discussion
The Most kritiska steg i CLOuD9 kromatin looping är: 1) utforma eller använda den rätta gRNAs, 2) föränderliga media dagligen på CLOuD9-sensorik celler, inklusive ABA eller DMSO, 3) att upprätthålla friskhet av ABA och 4) utför noggranna och försiktiga bedömningar av kromatin konformation.
Gränserna för CLOuD9 bosatta främst i förmågan att designa guider till målregionen i val. Guide RNAs utför den viktiga uppgiften att lokalisera de dCas9 komponenterna till målet DNA-regioner för att vara dimerized och effekten av guiderna är baserat på deras specifika målplatsen. Utan ordentlig gärna komponenterna inducerad den CLOuD9 systemet inte kommer att kunna bilda reversibelt loopar. Således, genom att utforma flera guider för varje region av intresse och sprida guider över en region av 250-1000 bp, minst en framgångsrik guide kommer att säkerställas. Guide läge är också integrerad till korrekta resultat. Det är viktigt att undvika guider i transkription faktorn bindande platser eller andra kritiska regioner för att förhindra bakgrundseffekter såsom uppåt eller nedåt förordning av transkription. Dessutom kan den exakta platsen för den CLOuD9 bygga något påverka transkription av målgenen. Detta betonar vikten av att testa flera par guider för varje målregion, att identifiera den mest robusta par i experimentsyfte. Ytterligare, i varje par målregionerna, den CSA konstruktionen bör riktas med gRNAs för S. aureusoch den CSP konstruktionen bör riktas med gRNAs för S. pyogenes för inriktning specificitet.
För att säkerställa korrekta resultat och rätta dimerization, är det också viktigt att upprätthålla friskhet av cellulära miljöer efter transduktion av CLOuD9 konstruktioner. Dagens media ändra och tillägg av färska dimerizer (eller kontroll) säkerställer att kompletterande konstruktioner kommer att förbli i närhet och bevara förändrad kromatin konformation. Dessutom är garanterar ABA är fräsch och har förvarats på rätt sätt enligt tillverkarens protokollet (öppnas inom 6 månader, förvaras kallt, skyddade från ljus) nödvändigt att erhålla giltiga resultat.
Bland annat användes den ABA dimerizer för CLOuD9 med ABI och PYL dimerization proteinerna, snarare än mer ofta används FRB och FKBP system. Nödvändigheten av en rapalog för FRB/FKBP systemet skulle ha begränsad tillämplighet CLOuD9, på grund av toxicitet för cancerceller. Det alternativa ABI/PYL systemet kringgå denna begränsning, effektivt att aktivera CLOuD9 vara bredare utilizable.
Sammantaget har vi utvecklat CLOuD9, en unik och robust teknik som kan våld men reversibelt skapa kontakter mellan långväga mål genomisk loci. Genom att inducera kromatin loopar, Visa vi också att CLOuD9 kan utnyttjas för att ändra genernas uttryck inom ramen för lämpliga cellulära. Anpassningsförmåga tekniken möjliggör obegränsad studien av interaktion mellan vilka två genomisk lokus, utan krav på förkunskaper Loopa regioner eller looping mekanismer. Dessutom möjliggör CLOuD9's unika påvisade reversibilitet ytterligare granskning av looping mekanismerna i sjukdom och utveckling. Även på målet effekterna av kromatin looping har visat tydligt, finns det ännu vara data som erbjuder inblick i effekterna av off-target looping och den efterföljande inverkan på öglorna på målet.
Våra data visar endast några tillämpningar av detta verktyg men innebär större underliggande tanken att kromatin arrangemang är vägledande av genuttryck. Vår teknik kan användas för att studera och avslöja nyanserna i kromatinstrukturen i genreglering, därigenom förbättra övergripande förståelsen av rollen av kromatin vikning i transkription av gener. En bättre förståelse av subtiliteter transkriptionell dynamics kan leda vägen i forskning och behandling av cancer, ärftliga sjukdomar och medfödda störningar, i vilka distinkta kromatin församlingen otvivelaktigt förändrar gen uttryck20, 21,22,23. Efterföljande arbete utnyttja den CLOuD9 tekniken kommer att belysa ytterligare detaljer om arrangemang och dynamik av kromatin domäner och hur de kör fällbara för att upprätthålla stabila genuttryck i både utveckling och sjukdom.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, s. Batista, E. Calo och hela Wang laboratoriet för teknisk support och kritisk läsning av manuskriptet. S.L.M. har fått stöd i detta arbete genom NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) och National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. stöds av en karriär Award för medicinska forskare från Burroughs Wellcome fonden, och är en Donald E. och Delia B. Baxter Foundation fakulteten Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
| DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
| lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
| pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
| pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
| pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
| anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
| anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
| Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
| SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
| Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
| anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
| anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
| EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
| 4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
| anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
| Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
| PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
| FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
| FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
| 10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
| T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
| 2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
| Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
| Buffers | |||
| Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
| Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
| IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
| Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
| Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
| Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
| IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |
References
- Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
- Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
- Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
- Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
- Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
- Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
- Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
- Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
- Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, 13 July (2017).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Lipofectamine 2000 Reagent. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).
- DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2006).
- Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , New England BioLabs. (2016).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
- Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
- RNeasy Mini Handbook. , QIAGEN. (2012).
- SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).
- Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
- Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
- Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
- Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
- Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
