Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели
Summary
Эта статья представляет простой и экономического протокола для простой изоляция и очищение мезенхимальных стволовых клеток из Новой Зеландии белый кролик синовиальной жидкости.
Abstract
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) являются источником основной ячейки для терапии на основе ячеек. MSCs от суставная полость синовиальной жидкости могут потенциально использоваться для хряща тканевой инженерии. MSCs с синовиальной жидкости (SF-MSCs) рассматривались в качестве перспективных кандидатов для регенерации суставного, и их потенциальных терапевтических выгод сделало их важной исследовательской темы в последнее время. SF-MSCs от колена полости Новой Зеландии белый кролик могут использоваться как оптимизированный трансляционная модель для оценки человека регенеративной медицины. С помощью на основе CD90 магнитные активированных клеток Сортировка (ПДК) технологии этот протокол успешно получает кролик SF-MSCs (rbSF-MSCs) от этой модели кролика и далее в полной мере демонстрирует MSC фенотип этих клеток, вызывая их различать в остеобласты, адипоциты и хондроцитов. Таким образом этот подход может быть применен в биологии исследования клеток и тканевой инженерии с использованием простой оборудования и процедур.
Introduction
MSCs были предложены как ценный источник для регенеративной медицины, особенно для поражения хряща. MSCs, включая хондроцитов, остеобласты, адипоциты, скелетные миоциты и висцеральных стромальные клетки, широко расширить области для трансплантации стволовых клеток из-за их высокой расширение скорость и несколькими линии дифференциации потенциальных1. МСК могут быть изолированы от скелетных мышц, синовиальной оболочки, костного мозга и жировой ткани2,3,4. Выводы также выясняется наличие MSCs в синовиальной жидкости, и предыдущие исследования выявили синовиальной жидкости производные MSCs (SF-MSCs) как перспективных кандидатов для регенерации суставного5,6.
Однако исследования и доклинические экспериментов на образцах подвергаются многие этические вопросы. Вместо этого кролики были и продолжают оставаться наиболее часто используемых видов животных, чтобы продемонстрировать, что трансплантация МСК можно отремонтировать повреждение хряща. В последние годы все большее число ученых изучили кролик мезенхимальных стволовых клеток (rbMSCs) как в пробирке и в естественных условиях, как эти клетки являются похож на человека MSCs в их клеточной биологии и тканей физиологии. Аналогично rbMSCs способны придерживаться пластиковых поверхностей, отображение шпинделя фибробластов морфологии как человека MSCs. Кроме того кролик мезенхимальных образцы являются простыми и легко получить7. Кроме того наиболее важные вопросы, что rbMSCs Экспресс поверхностных маркеров, например, CD44, CD90 и CD105, и что сохраняется мульти линии дифференциация потенциал, который согласуется критерии для идентификации населения MSC определяется международным обществом клеточной терапии8,9. В частности синовиальной жидкости chondroprogenitors способны не гипертрофическая chondrogenesis когда индуцированных TGF-β1, таким образом делая их источники подходящую ячейку для фенотипически суставного хряща регенерации10,11, 12.
Однако изоляции SF-MSCs значительно отличается от других тканей, в том числе пуповины, жировой ткани, периферической крови и костного мозга. В настоящее время наиболее распространенных подходов для очистки и сортировки SF-МСК являются проточной цитометрии и иммуномагнитная шарик-сортировка на основе, хотя метод цитометрия потоков требует конкретной среды и весьма дорогостоящих инструментов13.
Эта статья представляет процедура для простой и минимально инвазивной коллекции образцов синовиальной жидкости из Новой Зеландии белого кролика. Во время процедуры rbSF-MSCs, стабильно расширенной в пробирке и затем изолированы с CD90 положительное магнитное процедуры, основанные на шарик. Наконец протокол показывает, как получить MSCs с высокой чистоты и жизнеспособности из заготовленных клеток источников.
В этом протоколе изолированные rbSF-MSCs характеризуются, основанные на их морфологии, выражение определенных маркеров, и плюрипотентности для стволовых клеток. Потока на основе цитометрии Иммунофенотипирование показывает значительное положительное проявление CD44 и CD105, тогда как выражение CD45 и CD34 является отрицательным. Наконец в пробирке assay для rbSF-MSCs демонстрирует остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференциации этих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существование MSCs в синовиальной жидкости обеспечивает альтернативу для терапии на основе ячеек. Предыдущие исследования показали, что травмы сайты содержат большее количество мезенхимальных стволовых клеток в их синовиальной жидкости, которая может быть положительно коррелирует с ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансово поддержали следующие гранты: естественные науки фонд Китая (№ 81572198; № 81772394); Фонд для строительства высокого уровня медицинской дисциплины Шэньчжэнь университета (№ 2016031638); Фонд медицинских исследований провинции Гуандун, Китай (No. A2016314); Шэньчжэнь науки и технологических проектов (No. JCYJ20170306092215436; LOL JCYJ20170412150609690; LOL JCYJ20170413161800287; LOL SGLH20161209105517753; LOL JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
References
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
- De, B. C., Dell’Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
- Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
- Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
- Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
- Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
- Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
- Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
- Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
- Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
- John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
- Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
- Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
- Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
- Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
- Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
- Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
- Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
- Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
- Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).
