Dit artikel presenteert een eenvoudige en economische protocol voor het eenvoudig isolatie en zuivering van mesenchymale stamcellen uit Nieuw-Zeeland wit konijn gewrichtsvocht.
Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn de bron van de belangrijkste cel voor cel-gebaseerde therapie. MSCs van articulaire holte gewrichtsvocht zou kunnen worden gebruikt voor weefselengineering van kraakbeen. MSCs van gewrichtsvocht (SF-MSCs) zijn veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie beschouwd heeft, en hun potentiële therapeutische voordeel hen een belangrijk onderzoeksonderwerp van laat. SF-MSCs uit de holte van de knie van het Nieuw-Zeeland wit konijn kunnen worden ingezet als een geoptimaliseerde translationeel model te beoordelen van menselijke regeneratieve geneeskunde. Door middel van CD90 gebaseerde magnetische geactiveerde cel sorteren (MACS) technologieën, dit protocol met succes verkrijgt konijn SF-MSCs (rbSF-MSCs) van dit model konijn en volledig toont verder het fenotype van de MSC van deze cellen door het inducerende hen om te differentiëren naar Botcellen, adipocytes en chondrocyten. Daarom kan deze aanpak worden toegepast in het onderzoek van de biologie van de cel- en weefseltechnologie met behulp van eenvoudige apparatuur en procedures.
MSCs hebben gesuggereerd als een waardevolle bron voor regeneratieve geneeskunde, vooral voor kraakbeen letsels. MSCs, met inbegrip van de chondrocyten, botcellen, adipocytes, skelet myocytes en viscerale stromale cellen, expand in grote lijnen de gebieden voor stamceltransplantatie vanwege hun hoge uitbreiding tarief en multi lineage differentiatie potentiële1. MSCs kunnen worden geïsoleerd uit de skeletal muscle, synovia, beenmerg en adipeus weefsel2,3,4. Bevindingen hebben ook confirmed de aanwezigheid van MSCs in het gewrichtsvocht, en vorige onderzoek synoviale vloeistof afkomstige MSCs (SF-MSCs) heeft geïdentificeerd als veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie5,6.
Onderzoek en preklinische experimenten met menselijke specimens zijn echter onderworpen aan veel ethische kwesties. In plaats daarvan, konijnen geweest en blijven de meest gebruikte diersoorten om aan te tonen dat de transplantatie van MSCs kraakbeenletsels kan repareren. In de afgelopen jaren een stijgend aantal onderzoekers hebben bestudeerd konijn mesenchymale stamcellen (rbMSCs) beide in vitro en in vivo, als deze cellen zijn vergelijkbaar met menselijke MSCs in hun cellulaire biologie en weefsel fysiologie. Ook zijn de rbMSCs geschikt voor het vasthouden aan kunststofoppervlakken, spindel-fibroblast morfologie in menselijke MSCs weergeven. Bovendien, konijn mesenchymale monsters zijn eenvoudig en gemakkelijk te verkrijgen van7. Bovendien, zijn de meest cruciale punten dat rbMSCs express oppervlakte markers, zoals CD44, CD90 en CD105, en dat de potentiële multi lineage-differentiatie is bewaard gebleven, die is in overeenstemming met de criteria voor de identificatie van MSC populaties als gedefinieerd door de International Society for cellulaire therapie8,9. In het bijzonder de synoviale vloeistof chondroprogenitors staat niet-hypertrofische chondrogenesis wanneer geïnduceerd door TGF-β1, waardoor ze geschikt mobiele bronnen voor fenotypische articulair kraakbeen regeneratie10,11, zijn 12.
Het isolement van de SF-MSCs verschilt echter sterk van andere weefsels, met inbegrip van de navelstreng, adipeus weefsel, perifeer bloed en beenmerg. Momenteel zijn de meest voorkomende benaderingen voor de zuivering en sortering van SF-MSCs stroom cytometry en immunomagnetic kraal gebaseerde sorteren, hoewel de stroom cytometry methode een specifieke omgeving en zeer dure instrumenten13 vereist.
Dit artikel presenteert een procedure voor het eenvoudig en minimaal invasieve collectie van monsters van synoviale vloeistof uit Nieuw-Zeeland witte konijnen. Tijdens de procedure, de rbSF-MSCs zijn stabiel uitgevouwen in vitro en vervolgens geïsoleerd met CD90 positieve magnetische kraal gebaseerde procedures. Tot slot, het protocol laat zien hoe MSCs met een hoge zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geoogste cel bronnen verkrijgen.
In dit protocol worden de geïsoleerde rbSF-MSCs gekenmerkt op basis van hun morfologie, de expressie van specifieke markers en pluripotent voor stamcellen. Stroom cytometry gebaseerde immunophenotyping blijkt een aanzienlijke positieve uitdrukking van CD44 en CD105, overwegende dat de uitdrukking van CD45 en de CD34 negatief is. Tot slot, een in vitro assay voor rbSF-MSCs toont de differentiatie van het osteogenic, adipogenic en chondrogenic van deze cellen.
Het bestaan van MSCs in gewrichtsvocht biedt een alternatief voor cel-gebaseerde therapie. Eerdere studies hebben aangetoond dat letsel sites bevatten hogere hoeveelheden mesenchymale stamcellen in hun gewrichtsvocht, die positief kunnen worden gecorreleerd met de periode van na letsel5. De MSCs in gewrichtsvocht kunnen zinvol zijn om weefsel voor het verbeteren van de spontane genezing na een letsel18,19. De klinische toepassing van SF-MS…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd financieel ondersteund door de volgende subsidies: de Natural Science Foundation van China (nr. 81572198; Nr. 81772394); het Fonds voor hoog niveau medische Discipline bouw van Universiteit Shenzhen (nr. 2016031638); de medische Research Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. A2016314); en Shenzhen wetenschaps- en technologieprojecten (nr. JCYJ20170306092215436; Nr. JCYJ20170412150609690; Nr. JCYJ20170413161800287; Nr. SGLH20161209105517753; Nr. JCYJ20160301111338144).
Reagents | |||
MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
Equipment | |||
MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |