चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई रणनीतियों को अलग करने और शुद्ध श्लेष द्रव-व्युत्पंन Mesenchymal एक खरगोश मॉडल से स्टेम कोशिकाओं
Summary
यह लेख सीधा अलगाव और ंयूजीलैंड सफेद खरगोश श्लेष द्रव से mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के शोधन के लिए एक सरल और आर्थिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ।
Abstract
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए मुख्य सेल स्रोत हैं । जोड़दार गुहा श्लेष द्रव से MSCs संभवतः उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । श्लेष द्रव (एस एफ-MSCs) से MSCs जोड़दार उत्थान के लिए होनहार उंमीदवार माना गया है, और उनके संभावित चिकित्सीय लाभ उंहें देर से एक महत्वपूर्ण शोध का विषय बना दिया है । एस एफ-ंयूजीलैंड के घुटने गुहा से MSCs सफेद खरगोश मानव अपक्षयी दवा का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित शोधों मॉडल के रूप में नियोजित किया जा सकता है । CD90 आधारित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) प्रौद्योगिकियों के माध्यम से, इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक खरगोश एस एफ-MSCs (rbSF-MSCs) इस खरगोश मॉडल से प्राप्त करता है और आगे पूरी तरह से उन्हें अंतर करने के लिए उत्प्रेरण द्वारा इन कोशिकाओं के एमएससी phenotype को दर्शाता है osteoblasts, adipocytes, और chondrocytes । इसलिए, इस दृष्टिकोण सेल जीवविज्ञान अनुसंधान और ऊतक इंजीनियरिंग में सरल उपकरण और प्रक्रियाओं का उपयोग कर लागू किया जा सकता है ।
Introduction
MSCs, विशेष रूप से उपास्थि घावों के लिए, अपक्षयी दवा के लिए एक मूल्यवान स्रोत के रूप में सुझाव दिया गया है । chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, कंकाल myocytes, और आंत stromal कोशिकाओं सहित MSCs, मोटे तौर पर अपने उच्च विस्तार दर और बहु वंश विभेद संभावित1के कारण स्टेम सेल प्रत्यारोपण के लिए क्षेत्रों का विस्तार । MSCs कंकाल की मांसपेशी, synovium, अस्थि मज्जा, और वसा ऊतक2,3,4से अलग किया जा सकता है । निष्कर्ष भी श्लेष द्रव में MSCs की उपस्थिति confirmed है, और पिछले अनुसंधान श्लेष द्रव-व्युत्पंन MSCs (एस एफ-MSCs) जोड़दार पुनर्जनन5,6के लिए होनहार उंमीदवारों के रूप में पहचान की है ।
हालांकि, मानव नमूनों पर अनुसंधान और नैदानिक प्रयोग कई नैतिक मुद्दों के अधीन हैं । इसके बजाय, खरगोशों गया है और सबसे अधिक इस्तेमाल किया जानवर प्रजातियों के लिए MSCs के प्रत्यारोपण का प्रदर्शन उपास्थि क्षति की मरंमत कर सकते है प्रदर्शित होने के लिए जारी है । हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं की एक बढ़ती हुई संख्या खरगोश mesenchymal स्टेम सेल (rbMSCs) दोनों विट्रो में और vivo मेंअध्ययन किया है, के रूप में इन कोशिकाओं को अपने सेलुलर जीव विज्ञान और ऊतक फिजियोलॉजी में मानव MSCs के समान हैं. इसी तरह, rbMSCs प्लास्टिक सतहों का पालन करने में सक्षम हैं, धुरी-fibroblast मानव MSCs के रूप में आकृति विज्ञान प्रदर्शित । इसके अलावा, खरगोश mesenchymal नमूने सरल और7प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, सबसे महत्वपूर्ण बिंदु है कि rbMSCs एक्सप्रेस ऐसी CD44, CD90 के रूप में सतह मार्करों, और CD105, और है कि बहु वंश भिंनता क्षमता संरक्षित है, जो एमएससी आबादी की पहचान के लिए मानदंड के साथ समझौते में है सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा परिभाषित8,9. विशेष रूप से, श्लेष द्रव chondroprogenitors गैर में सक्षम है hypertrophic chondrogenesis जब TGF द्वारा प्रेरित-β1, इस प्रकार उंहें phenotypically जोड़दार उपास्थि पुनर्जनन10,11के लिए उपयुक्त सेल सूत्रों बनाने, 12.
हालांकि, एस एफ के अलगाव-MSCs गर्भनाल, वसा ऊतक, परिधीय रक्त, और अस्थि मज्जा सहित अंय ऊतकों से बहुत अलग है । वर्तमान में, शुद्धि और एस एफ-MSCs की छंटाई के लिए सबसे आम दृष्टिकोण प्रवाह cytometry और immunomagnetic मनका-छंटाई आधारित हैं, हालांकि प्रवाह cytometry विधि एक विशिष्ट वातावरण और बहुत महंगा उपकरणों13की आवश्यकता है ।
यह लेख ंयूजीलैंड सफेद खरगोशों से श्लेष द्रव के नमूनों की सरल और ंयूनतम इनवेसिव संग्रह के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है । प्रक्रिया के दौरान, rbSF-MSCs इन विट्रो में विस्तार कर रहे है और फिर CD90 सकारात्मक चुंबकीय मनका आधारित प्रक्रियाओं के साथ अलग । अंत में, प्रोटोकॉल से पता चलता है कि एक उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ MSCs प्राप्त करने के लिए काटा सेल सूत्रों ।
इस प्रोटोकॉल में, अलग rbSF-MSCs उनकी आकृति विज्ञान, विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति, और स्टेम सेल के लिए pluripotency के आधार पर विशेषता है । प्रवाह cytometry आधारित immunophenotyping CD44 और CD105 की एक महत्वपूर्ण सकारात्मक अभिव्यक्ति का पता चलता है, जबकि CD45 और CD34 की अभिव्यक्ति नकारात्मक है । अंत में, एक इन विट्रो rbSF के लिए परख-MSCs osteogenic, adipogenic, और इन कोशिकाओं के chondrogenic भेदभाव दर्शाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
श्लेष द्रव में MSCs का अस्तित्व कोशिका-आधारित चिकित्सा के लिए एक विकल्प प्रदान करता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि चोट साइटों को अपने श्लेष द्रव में mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की उच्च मात्रा में होते हैं, ज?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के आर्थिक रूप से निंनलिखित अनुदान द्वारा समर्थित था: चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No. ८१५७२१९८; No. ८१७७२३९४); शेन्ज़ेन विश्वविद्यालय के उच्च स्तरीय चिकित्सा अनुशासन निर्माण के लिए निधि (No. २०१६०३१६३८); गुआंग्डोंग प्रांत के मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, चीन (सं. A2016314); और शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं. JCYJ20170306092215436; नहीं. JCYJ20170412150609690; नहीं. JCYJ20170413161800287; नहीं. SGLH20161209105517753; नहीं. JCYJ20160301111338144) ।
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
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