Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio
Summary
Questo articolo presenta un protocollo semplice ed economico per il semplice isolamento e purificazione delle cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale di coniglio bianco di Nuova Zelanda.
Abstract
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono la fonte principale delle cellule per terapia cellulare. MSCs dal liquido sinoviale cavità articolare potrebbero essere utilizzati per l’ingegneria tissutale della cartilagine. MSCs dal liquido sinoviale (SF-MSCs) sono stati considerati promettenti candidati per rigenerazione articolare, e loro potenziale beneficio terapeutico li ha resi un tema di ricerca importante di ritardo. SF-MSCs dalla cavità del ginocchio del coniglio bianco di Nuova Zelanda può essere impiegato come un modello traslazionale ottimizzato per valutare umana medicina rigenerativa. Per mezzo di CD90-base magnetica attivato cella (MACS) tecnologie di differenziazione, questo protocollo ottiene correttamente coniglio SF-MSCs (rbSF-MSCs) da questo modello di coniglio e completamente dimostra ulteriormente il fenotipo MSC di queste cellule inducendo loro di differenziarsi per osteoblasti, adipociti e condrociti. Di conseguenza, questo approccio può essere applicato nella ricerca di biologia cellulare e tissutale utilizzando procedure e attrezzature semplici.
Introduction
MSCs sono stati suggeriti come una preziosa fonte per la medicina rigenerativa, soprattutto per le lesioni della cartilagine. MSCs, tra cui condrociti, osteoblasti, adipociti, miociti scheletrici e viscerali cellule stromali, largamente espandere le aree per il trapianto di cellule staminali a causa della loro alta espansione tasso e multi-lignaggio differenziazione potenziali1. MSCs può essere isolato dal scheletrico muscolare, synovium, midollo osseo e del tessuto adiposo2,3,4. Risultati hanno inoltre confermato la presenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale, e precedente ricerca ha identificato MSCs derivato liquido sinoviale (SF-MSCs) come candidati promettenti per rigenerazione articolare5,6.
Tuttavia, ricerca e sperimentazione preclinica su campioni umani sono soggetti a molte questioni etiche. Invece, i conigli sono stati e continuano ad essere il più comunemente usato specie animali per dimostrare che il trapianto di cellule staminali mesenchimali può riparare il danno della cartilagine. Negli ultimi anni, un numero crescente di ricercatori hanno studiato le cellule staminali mesenchimali coniglio (rbMSCs) entrambi in vitro e in vivo, come queste cellule sono simili all’essere umano MSCs nella loro fisiologia biologia e tessuto. Allo stesso modo, il rbMSCs sono in grado di aderire a superfici in plastica, visualizzazione morfologia dell’alberino-fibroblasto come MSCs umane. Inoltre, campioni mesenchymal coniglio sono semplici e facili da ottenere7. Inoltre, i punti più cruciali sono che rbMSCs esprimono marcatori di superficie, quali CD44, CD90 e CD105, e che sia preservata la differenziazione multi-lignaggio potenziale, che è d’accordo con i criteri per l’identificazione delle popolazioni di MSC come definito dalla società internazionale per la terapia cellulare8,9. In particolare, sono in grado di non-ipertrofica Condrogenesi quando indotto dal TGF-β1, rendendoli così fonti di cellule adatto per cartilagine articolare fenotipico rigenerazione10,11, chondroprogenitors fluido sinoviale 12.
Tuttavia, l’isolamento della SF-MSCs è notevolmente diverso da altri tessuti, compreso il cordone ombelicale, il tessuto adiposo, sangue periferico e midollo osseo. Attualmente, gli approcci più comuni per la purificazione e l’ordinamento di SF-MSCs sono citometria a flusso e immunomagnetica ordinamento basato su tallone, anche se il metodo di cytometry di flusso richiede un ambiente specifico e altamente costosi strumenti13.
Questo articolo presenta una procedura per la raccolta semplice e minimamente invasiva di campioni di liquido sinoviale dalla Nuova Zelanda conigli bianchi. Durante la procedura, il rbSF-MSCs sono stabilmente espanse in vitro e quindi isolato con CD90 positive procedure basate su tallone magnetiche. Infine, il protocollo viene illustrato come ottenere MSCs con elevata purezza e vitalità dalle fonti delle cellule raccolte.
In questo protocollo, l’isolato rbSF-MSCs sono caratterizzati base alla loro morfologia, espressione di marcatori specifici e pluripotenza delle cellule staminali. Flusso cytometry-basata immunophenotyping rivela una significativa espressione positiva di CD44 e CD105, mentre l’espressione di CD45 e CD34 è negativo. Infine, un test in vitro per rbSF-MSCs illustra la differenziazione osteogenica, adipogenico e condrogenica di queste cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’esistenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale fornisce un’alternativa per la terapia cellulare. Gli studi precedenti hanno dimostrato che lesioni siti contengono una maggiore quantità di cellule staminali mesenchimali in loro liquido sinoviale, che può essere correlata positivamente con il periodo di alberino-ferita di5. MSCs nel liquido sinoviale può essere favorevole al tessuto per migliorare la guarigione spontanea dopo un infortunio18,</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalle seguenti sovvenzioni: il Natural Science Foundation della Cina (n. 81572198; N. 81772394); il fondo per la costruzione di alto livello disciplina medica della Università di Shenzhen (No. 2016031638); il fondamento di ricerca medica della provincia del Guangdong, Cina (No. A2016314); Scienza di Shenzhen e progetti tecnologici (No. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
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