Denne artikkelen presenterer en enkel og økonomisk protokoll for enkel isolasjon og rensing av mesenchymal stamceller fra New Zealand hvit kanin synovial væske.
Stamceller (MSCs) er den viktigste celle for celle-basert terapi. MSCs fra articular hulrom synovial væske kan potensielt brukes brusk vev engineering. MSCs fra synovial væske (SF-MSCs) har vært betraktet som lovende kandidater for articular gjenfødelse, og deres potensielle terapeutiske fordel har gjort dem en viktig forskning emne for sent. SF-MSCs fra i kneet hulrommet i New Zealand hvite kaninen kan anvendes som en optimalisert translasjonsforskning modell å vurdere menneskelige regenerativ medisin. Ved hjelp av CD90-baserte magnetiske aktivert celle sortering (Mac) teknologier, denne protokollen henter vellykket kanin SF-MSCs (rbSF-MSCs) fra denne kanin modellen og ytterligere viser fullt MSC fenotypen av disse cellene av til å differensiere å osteoblasts, adipocytter og chondrocytes. Derfor kan denne tilnærmingen brukes i biologi forskning og vev engineering bruker enkel utstyr og prosedyrer.
MSCs har blitt foreslått som en verdifull kilde for regenerativ medisin, spesielt for brusk lesjoner. MSCs, inkludert chondrocytes, osteoblasts, adipocytter, skjelettlidelser myocytter og visceral stromal celler, bredt utvide områdene for stilk cellen transplantasjon på grunn av deres høye ekspansjon rate og flere avstamning differensiering potensielle1. MSCs kan isoleres fra skjelettlidelser muskler, fagområder, benmargen og fettvev2,3,4. Funnene har også confirmed tilstedeværelsen av MSCs i synovial væske, og tidligere forskning har identifisert synovial fluid-avledet MSCs (SF-MSCs) som lovende kandidater i articular gjenfødelse5,6.
Men er forskning og prekliniske eksperimentering på prøver fra mennesker underlagt mange etiske spørsmål. I stedet kanin har vært og fortsetter å være mest brukte dyrearter for å demonstrere at transplantasjon av MSCs kan reparere skader brusk. De siste årene, et økende antall forskere har studert kanin mesenchymal stamceller (rbMSCs) både i vitro og i vivo, disse cellene er ligner menneskelige MSCs i mobilnettet biologi og vev fysiologi. Tilsvarende er er rbMSCs i stand til å overholde plast overflater, vise spindel-fibroblast morfologi som menneskelige MSCs. Videre er kanin mesenchymal prøvene enkel og lett å få7. I tillegg er de viktigste punktene at rbMSCs express overflate markører, som CD44, CD90 og CD105, og at flere avstamning differensiering potensielle er bevart, som er i samsvar med kriteriene for identifikasjon av MSC populasjoner som definert av internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi8,9. Spesielt er synovial væske chondroprogenitors i stand til ikke-hypertrofisk chondrogenesis når indusert av TGF-β1, dermed gjør dem egnet cellen kilder for svært articular brusk gjenfødelse10,11, 12.
Isolasjon av SF-MSCs er imidlertid svært forskjellig fra andre vev, inkludert navlestreng, fettvev, perifert blod og benmarg. Tiden, er de vanligste metodene for rensing og sortering av SF-MSCs flowcytometri og immunomagnetic perle-basert sortering, selv om flyt cytometri metoden krever et bestemt miljø og svært dyr instrumenter13.
Denne artikkelen presenterer en prosedyre for enkel og minimal invasiv innsamling av prøver av synovial væske fra New Zealand hvit kanin. Under inngrepet, rbSF-MSCs stabilt utvidet i vitro og deretter isolert CD90 positive magnetiske perle-baserte prosedyrer. Til slutt, protokollen viser hvordan å få MSCs med høy renhetsgrad og levedyktighet fra høstet celle kilder.
I denne protokollen kjennetegnes av isolerte rbSF-MSCs basert på deres morfologi, uttrykk for bestemte dataindikatorer og pluripotency for stamceller. Flow cytometri-baserte immunophenotyping avslører en betydelig positiv uttrykk for CD44 og CD105, mens uttrykk for CD45 og CD34 er negativt. Til slutt, i vitro analysen for rbSF-MSCs viser osteogenic, adipogenic og chondrogenic differensiering av disse cellene.
Eksistensen av MSCs i synovial væsken gir et alternativ for cellen-basert terapi. Tidligere studier har vist at skade områder inneholder større mengder mesenchymal stamceller i deres synovial væske, som kan være positivt korrelert med etter skade perioden5. MSCs i synovial væske kan være gunstig for vev for å øke spontan helbredelse etter en skade18,19. Klinisk anvendelse av SF-MSCs har sjelden blitt dekket i litteraturen, hovedsa…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble økonomisk støttet av følgende tilskudd: Natural Science Foundation i Kina (nr. 81572198; Nei 81772394); Fondet for høyt nivå medisinsk disiplin byggingen av Shenzhen University (nr. 2016031638); Medisinsk forskning grunnvoll Guangdong provinsen, Kina (nr. A2016314); og Shenzhen vitenskap og teknologi-prosjekter (nr. JCYJ20170306092215436; nei. JCYJ20170412150609690; nei. JCYJ20170413161800287; nei. SGLH20161209105517753; nei. JCYJ20160301111338144).
Reagents | |||
MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
Equipment | |||
MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |