Summary
Over en rekke sykdom indikasjoner blir flere fysiologisk relevante modeller utviklet og implementert i stoffet funnet programmer. Den nye modell systemet beskrevet her demonstrerer hvordan tredimensjonale svulst spheroids kan kultivert og vist i en høy gjennomstrømming 1536-vel plate-basert system til å søke etter nye onkologi stoffer.
Abstract
Kreftceller har rutinemessig er kultivert i to dimensjoner (2D) på plast underlag. Denne teknikken, men mangler det ekte miljøet en svulst masse er utsatt for i vivo. Solide svulster vokser ikke som ark festet til plast, men i stedet som en samling klonal celler i en tredimensjonal (3D) plass samspill med sine naboer, og med forskjellige romlige egenskaper som avbrudd i normal mobilnettet polaritet. Disse føre 3D-kulturperler celler å erverve morfologiske og mobilnettet egenskaper som til i vivo svulster. I tillegg en svulst er i direkte kontakt med andre celletyper som stromal og immunsystemet cellene, samt den ekstracellulære matrisen fra alle andre celletyper. Matrix avsatt består av macromolecules for eksempel kollagen og fibronectin.
I et forsøk på å øke oversettelsen av forskningsresultater i onkologi fra benken til sengen, begynt mange grupper å undersøke bruk av 3D-modellsystemer i sine narkotikastrategier utvikling. Disse systemene er antatt å være mer fysiologisk relevant fordi de prøver å recapitulate komplekse og heterogene miljø av en svulst. Disse systemene, men kan være ganske komplisert, og selv om det er mottakelig for vekst i 96-brønnen formater, og noen nå også i 384, tilbyr noen valg for store vekst og screening. Dette observert gapet har ført til utviklingen av metodene som er beskrevet her i detalj til kultur svulst spheroids i en høy gjennomstrømming kapasitet i 1536-og plater. Disse metodene representerer et kompromiss til komplekse matrix-baserte systemer, som er vanskelig å skjermen og konvensjonelle 2D analyser. En rekke kreftcelle linjer huse forskjellige genetiske mutasjoner er vellykket screenet, undersøke sammensatte effekt ved hjelp av et kuratert bibliotek av forbindelser målretting Mitogen-Activated Protein Kinase eller MAPK veien. Spheroid kultur svarene er deretter sammenlignet med responsen av celler dyrket i 2D, og differensial aktiviteter blir rapportert. Disse metodene gir en unik protokoll for testing sammensatt aktivitet i høy gjennomstrømming 3D omgivelser.
Introduction
I det siste tiåret, har flere og flere studier implementert bruk av 3D celle kultur modeller å forstå begreper som ikke er fullt recapitulated av voksende celler i 2D på plast. Eksempler på disse begrepene er alternations i normal epithelial celle polaritet1 hvor den romlig orienteringen av apikale og basal lag av celler som er tapt, i tillegg til rollen den ekstracellulære matrisen i å regulere overlevelse og celle skjebne. Onkologi research, spesielt har brukt 3D modeller for å forstå grunnleggende biologi kreftceller og forskjellene mellom 2D og 3D celle kultur systemer3,4. Utviklingen av mer sofistikert celle kultur teknikker og deres ytterligere tilpasning til flere godt formater har aktivert Søk etter nye stoffer i 3D innstillinger. I motsetning til celler dyrket vilkår 2D, 3D-modeller av svulster varierer i kompleksitet fra lagdelte cellulær systemer5 til single-celle-type sfærer av forskjellige størrelser, til komplekse multi-cell-type kuler6,7, 8. oppdagelsen av romanen forbindelser eller biologiske som potently indusere celledød i systemene 3D-modellen er derfor høy interesse for narkotika utvikling kampanjer. Endepunktene på disse analyser er ofte identisk med de i 2D kulturer å vurdere endringer i celle spredning, men når gjennomført i en mer fysiologisk innstillingen, de kan avdekke sant nivået av avhengighet av målet genet eller veien blir avhørt.
Som introdusert over, en rekke modellsystemer er utviklet for å studere medikament reaksjoner i 3D kultur systemer, men fleste bruker enten 96 eller 384-vel være ferdig innen plater og er ikke lett tilpasses til høy gjennomstrømming screening (HTS) formater ofte brukt i Drug discovery screening kampanjer. Slike systemer inkluderer bruk av hengende slippverktøy teknologier, formet kulturer, pulserende celler med magnetiske partikler å indusere levitation og kulturer omfatter naturlige eller syntetiske gels som kollagen, Matrigel eller polyetylenglykol (PEG)2 . Her presenterer vi detaljerte metoder for en tidligere utviklet teknikk for å produsere 3D-formet kulturer fra etablerte kreftcelle linjer i 1536-vel plate format. I denne protokollen brukes en svært definerte medium som hindrer feste normalt tilhenger cellen linjer9. Dette systemet har begrensninger (dvs.den ikke fullt recapitulate et kompleks system av kreft), men likevel disse analyser aktivere en høy gjennomstrømming screening av store samlinger av små molekyler og tverrgående sammenligninger av narkotika-respons mellom 2D og 3D kulturer mot en rekke linjer og forbindelser.
Cellelinjer valgt for å demonstrere metodene i denne artikkelen alle harbor mutasjoner i gener knyttet til MAPK signalveien, en sti som er svært dysregulated i kreft, og som mange therapeutics er tilgjengelig. Mye av det har aktiveringen kreftfremkallende mutasjoner i Kirsten rotte sarkomspesialitet viruset også referert til som KRAS, neuroblastom RAS eller NRAS, Harvey rotte sarkomspesialitet virus oncogene eller HRAS og de tilknyttede kinaser raskt akselerert Fibrosarcomas, også kjent som RAFs. Litteraturen antyder at hemmere av forskjellige noder av denne veien er unikt mer effektiv i et delsett av cellen linjene når dyrket under 3D forhold9,10. En studie fant at når celler med aktive RAS ble kultivert i 3D, de viste en økt følsomhet for MAPK hemmere, og videre at denne tilnærmingen kan identifisere veier og målrettet hemmere som kunne være savnet i tradisjonelle 2D innstilling. Målet med denne studien er å presentere metoder brukt for å kultur disse linjer, og videre, for å demonstrere differensial Svar å disse hemmere som kan observeres bare når du bruker 3D celle kultur systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrking av 1536-vel 3D svulst Spheroids
- Forberede en fersk 3D svulst spheroid middels stamme (celle medium + knockout serum erstatning + insulin-transferrin-selen) ved å legge til følgende reagensene 500 mL Dulbeccos endret Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicillin/streptomycin, 10 ng/mL av menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), 20 ng/mL av menneskelig epidermal vekstfaktor (EGF), 0,4% bovin serum albumin (BSA) (brøkdel V), 1 x insulin-transferrin-selen og 1% knockout (KO) serum erstatning (ikke fryse-Tin).
- Filter-sterilisere hele mediet med kosttilskudd gjennom en 0,4 µm plastflaske-top filtersystem.
- Koble de kreftcelle linjene, som har vært økende ifølge anbefalte rutinemessig kultur forhold, fra de tradisjonelle cellekultur kolber ved å vaske dem 3 x med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) og legge til en passende mengde 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) i 5 min å skape et tynt lag over cellene. Nøytralisere trypsin med 5 x antall mediet som inneholder serum og fortsetter å telle celler. For eksempel bruk 25 mL av medium for 5 mL av trypsin.
- Justere konsentrasjonen av cellen løsningen 62,5 x 104 celler/mL for å frø totalt 500 celler per brønn i 8 µL av spheroid medium i 1536-og vev kultur-behandlet plater.
- I en biologisk sikkerhet skapet, frø cellene med en sterilisert, små rustfritt-stål-tipped kassett med peristaltiske-pumpe-basert system. Mellom forskjellige linjer, flush slangen av kassetten med 1 x PBS og 70% etanol for 10 s.
- Alternativt frø cellene med en flytende behandlingsprogram innenfor et HEPA-filtrert rom en sterilisert, små rustfritt-stål-tipped kassett og en peristaltiske pumpe eller en vedlagt sprøytepumpe, hvor mange plater per celle linje nødvendig.
- Forsegle plater ved hjelp av en pustende selvklebende plate sel enten manuelt eller en plate sealer.
- Sett platene i en spinning inkubator satt til 10 rpm og 37 ° C med 5% karbondioksid (CO2) og 95% relativ fuktighet. Kan spheroids til form for 3 d.
2. dyrking 1536-vel 2D kreft linjer
Merk: 1536-vel 2D kreft linjene skal kultivert 24 timer før tillegg av sammensatt å 3D platene.
- Forberede en 2D kreft cellen medium ved å legge til følgende reagensene 500 mL et passende vekst medium for de valgte linjene: 1 x penicillin/streptomycin og 10% fosterets bovin serum (FBS).
- Filter-sterilisere hele mediet med kosttilskudd gjennom en 0,4 µm plastflaske-top filtersystem.
- Koble de kreftcelle linjene, som har vært økende ifølge anbefalte rutinemessig kultur forhold, fra de tradisjonelle cellekultur kolber ved å vaske dem 3 x 1 x PBS og legge en passende mengde 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) for 5 min til opprette et tynt lag over cellene. Nøytralisere trypsin med 5 x antall mediet som inneholder serum og fortsetter å telle celler. For eksempel bruk 25 mL av medium for 5 mL av trypsin.
- Justere konsentrasjonen av cellen løsningen 62,5 x 104 celler/mL for å frø totalt 500 celler per brønn i 8 µL av komplett medium i 1536-og vev kultur-behandlet platene.
- I en biologisk sikkerhet skapet, frø cellene med en sterilisert, små rustfritt-stål-tipped kassett med peristaltiske-pumpe-basert system. Mellom ulike celle linjene, flush slangen av kassetten med 1 x sterilt PBS og 70% etanol for 10 s.
- Alternativt frø cellene med en flytende behandlingsprogram innenfor et HEPA-filtrert robotikk rom en sterilisert, små rustfritt-stål-tipped kassett og en peristaltiske pumpe eller tilknyttede sprøytepumpen, avhengig av platene per celle linje nødvendig.
- Forsegle plater ved hjelp av en pustende selvklebende plate sel enten manuelt eller en plate sealer.
- Sett platene i en spinning inkubator satt til 10 rpm og 37 ° C i 24 timer før sammensatte tillegg, med 5% CO2 og 95% relativ fuktighet.
3. sammensatte tillegg
- Forberede 8-punkts, 3-fold føljetong fortynninger av MAPK hemmere i 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) på en flytende-håndtering med en 10 mM topp konsentrasjon. Den proteasome inhibitor Bortezomib brukes som en positiv for en komplett celle drepe for å finne det dynamiske spekteret til analysen.
- Rask-rotere alle analysen og sammensatte plater på 100 x g å samle noen kondens. Fjern selvklebende forseglingen fra hver plate og plassere en plate på en akustisk dispenser oppsett til totalt 8 nL av hver sammensatte/fortynning representerer en siste konsentrasjon av 0,1% DMSO per brønn og en topp sammensatte dose 10 µM.
- Etter tillegg av sammensatte er fullført, Legg et skreddersydd, rustfritt stål celle kultur lokk som hindrer fordampning på tallerkenen og Plasser platen i en spinning inkubator på 37 ° C for 5 d, med 5% CO2 og 95% relativ fuktighet.
4. oppdagelsen reagens tillegg og oppnåelse av rådata
- Forvarm en tilstrekkelig volum på en celle lysis reagens som inneholder luciferin for å oppdage endringer i adenine trifosfat (ATP), og dermed endringene i celle spredning ved romtemperatur eller i en 37 ° C vannbad. Legge til totalt 3 µL av gjenkjenning reagensen i hver brønn ved hjelp av en peristaltiske pumpe og ruge platen ved romtemperatur i minst 15 min.
- Fange luminescence på en plate luminometer.
5. databehandling
- Ekstra rådata fra apparatet og normalisere alle felt som inneholder test forbindelser til gjennomsnittet av alle brønner med DMSO alene som nøytral kontrollen. Fra denne verdien, kan du beregne prosent vekst hemming av hver sammensatte. Denne fylles formel funksjonen i Microsoft Excel der f (x) = {(eksempel verdien relative lette enheter (RLUs) / (gjennomsnittsverdi DMSO RLUs) * 100)}.
- Generere dose-respons kurver og hemmende IC50s av grafiske verdiene normalisert data fra trinn 5.1 mot sammensatte konsentrasjonen bruker et grafisk program.
Merk: Vi analysert dataene med Helios et internt NIBR programvareverktøy. For å fullføre denne funksjonen, valgte vi analyseverktøyet parametriske kurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En rekke etablerte kreftcelle linjer kjent for å vokse godt under 2D oppdrettsforholdene ble testet ved hjelp av metodene beskrevet her. Representant bilder fra en rekke MAPK mutant kreft cellelinjer (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS og KNS-62:HRAS) er sett i figur 1. Bildene viser at selv om cellelinjer har ulike morphologies, hver dannet 3D strukturer i 1536-vel analysen platene. Figur 2 viser at, når det brukes store screening, kan differensial sammensatte følsomhet mellom kulturer dyrket i 2D versus de i 3D observeres. Hvert punkt på grafen representerer en sammensatts inhibitoriske konsentrasjon hvor det er en 50% celle mordene eller det sammensatte IC50 respons i begge innstillingene. For å demonstrere at effekten ikke er formidlet av forskjellige media, ble Calu-6 celler kultivert i samme media 2D vev-kulturperler plater eller 3D Scivax biofilm plater som hindrer vedlegg. Økt følsomhet eller lavere IC50 for 3D vekst betingelsen er sett i supplerende figur 1 for to forbindelser i samme media. Linjer som Calu-6 viser en økt følsomhet for forbindelsene når dyrket under 3D forhold, mens linjer som SK-MEL-30 er mindre følsomme i 3D forhold til 2D. Tabell 1 inneholder ytterligere bakgrunnsinformasjon om alle cellelinjer som ble brukt i dette skjermbildet.
Eksempler på representant dose-respons kurver er visualisert i Figur 3. Denne illustrasjonen viser differensial effekten av to forbindelser, RAF265 (figur 3A) og RAF709 (figur 3B), som hemmer aktiviteten til RAF kinaser. Begge forbindelser er sterkere i 3D forhold i Calu-6, som er en ikke-småcellet lungekreft linje harboring Q61K, en aktivering mutasjon i protein KRAS. Samtidig er både forbindelser tilsvarende potente i 3D spheroids og 2D kulturer fra HCT116 kolon kreft linjen, som inneholder G13D-aktivering mutasjon i KRAS. For å demonstrere at effekten av økt følsomhet er formidlet av vekst tilstanden til 3D versus 2D og ikke bare av ulike medier vilkårene, Calu-6 celler var vokst bruker FBS begge betingelsene. Som sett i supplerende figur 1, når både 2D og 3D bruker FBS, viser 3D kultur fremdeles en økt følsomhet for forbindelsene som produserer et lavere IC50.
Til slutt, 3D analysen også tillatt en observasjon av fenomenet paradoksale vekst aktivisering, hvilke oppstå når det er en ufullstendig hemming av RAF dimers svært aktivert RAS mutant linjer, og ikke i dimer uavhengig veien aktivisering i BRAF V600E mutasjoner11,12. Denne aktiveringen ses i Figur 4, på behandling med BRAF hemmer Dabrafenib under 3D forhold i KNS-62, en HRAS-mutert liten celle lunge kreft linje, og også i atypisk BRAF mutant bukspyttkjertelen cellen linje BxPC-3. Veksten er aktivert i lave konsentrasjoner av stoffet, og veksten er bare undertrykket på høye konsentrasjoner av stoffet (figur 4B). Denne aktivisering var overraskende ikke sett i KRAS mutant linjen Calu-6 og må ikke forventes i V600E BRAF mutant linjen A375. Vi har observert en paradoksal aktivering av Calu-6 med andre 3D vekst modeller (data ikke vist).
Figur 1: representant bilder av kreftceller vokser i 3D 1536-vel plater. Celler var belagt totalt 3 d i 1536-vel plater ved hjelp av en reagens dispenser og en liten kassett. Bright-feltet bilder ble anskaffet en invertert mikroskop med en 4 X linsen, viser de ulike 3D morphologies MAPK mutant celle linjene Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS og KNS-62:HRAS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: et spredningsdiagram sammenligne 2D - versus 3D-sammensatte effekten over cellelinjer. Spheroids, som ble generert tidligere for 3 d, ble deretter behandlet med forbindelser for en ekstra 5 d før sammensatte effekten ble bestemt. Hver sirkel representerer et unikt sammensatt svar. Endringer i celle spredning ble oppdaget ved hjelp av en lytisk celle spredning reagens, og IC50s ble beregnet ved hjelp av en fire-parameteren logistisk regresjonsanalyse med intern programvare kalt Helios. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dose-respons kurver sammenligne 2D - versus 3D-sammensatte efficacy. Dose-respons kurver viser sammensatte effekten sammenlignet med DMSO kontrollene. Kurvene KRAS mutant Calu-6 og HCT116-cellene behandlet med to RAF hemmere, RAF265 og RAF709, vises her som en prosentandel i endring i cellevekst (% vekst hemming) sammenlignet med DMSO styre brønner. En befolkning på cellene som ble dyrket under 2D forhold vises i rødt, og de vokst som 3D spheroids er i blått. De heltrukne linjene rundt data indikerer 95% konfidensintervall for hvert datasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: visse 3D kulturer fange fenomenet paradoksale vekst aktiveringstidspunktet. Dose-respons kurver viser sammensatte effekten (% vekst hemming) sammenlignet med DMSO kontrollene. Kurvene i KRAS mutant Calu-6, BRAF V600E mutant A375, HRAS mutant KNS-62 og atypisk BRAF mutant BxPC-3 cellene behandlet med en paradoksal aktivator Dabrafenib vises her. En befolkning på cellene som ble dyrket under 2D forhold vises i rødt, og de vokst som 3D spheroids er i blått. De heltrukne linjene rundt data indikerer 95% konfidensintervall for hvert datasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: Dose-respons kurver sammenligne 2D - versus 3D-sammensatte effekten i FBS inneholder medier. Dose-respons kurver viser sammensatte effekten sammenlignet med DMSO kontrollene. Kurvene i KRAS mutant Calu-6 cellene behandlet med to RAF hemmere, RAF265 og RAF709, vises her som en prosentandel i endring i cellevekst (% vekst hemming) sammenlignet med DMSO styre brønner. En befolkning på cellene som ble dyrket under 2D forhold vises i rødt, og de vokst som 3D spheroids er i blått. Begge vilkår bruk FBS inneholder medier. Feilfeltene representerer standard avvik fra 2 personlige datasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Navn på cellen | Avstamning | BRAF | RAS |
A-375 | Melanom | V600E | WT |
BxPC-3 | Bukspyttkjertelen | V487-P492 > A | WT |
Calu6 | Ikke-småcellet lungekreft | WT | KRAS Q61K |
HCT 116 | Colorectal | WT | KRAS G13C |
IPC-298 | Melanom | WT | NRAS Q61L |
KNS-62 | Plateepitel lunge | WT | HRAS Q61L |
NCI-H1299 | Lunge | WT | NRAS G12D |
PANC-1 | Bukspyttkjertelen | WT | KRAS G12D |
SKMEL-30 | Melanom | WT | NRAS Q61K |
Tabell 1: Celle informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene presenteres her viser en detaljert protokoll om hvordan å lage svulst spheroids i 1536-vel plater for store sammensatte screenings. Disse metodene ble opprinnelig tilpasset fra arbeid på National Cancer Institute hvor svulst spheroids ble dyrket i lav gjennomstrømming analyser i 6-vel og 96-brønns plater å stille spørsmål om genetisk avhengigheter og sammensatte følsomhet13, 14 , 15. en kritisk og unike funksjon i denne protokollen er at spheroids er dannet fra tradisjonell 2D vev-kulturperler celler i 1536-plater ved hjelp av definert medier kalles SCM + KO + ITS. Når cellene er seeded i, er de forseglet med pustende selvklebende plate sel å hindre noen fordampning over varigheten av 3 d-formet formasjon. Spheroids kan også bli kultivert for lengre perioder med denne tilnærmingen16. Etter 3 d sfære formasjonen legges forbindelser for 5 d før assaying endringene i cellevekst med en lytisk-baserte spredning reagens. Etter normalisering kontroll brønner og beregning av IC50s mellom celler kultivert i 2D og 3D, endringene i sammensatte behandlet cellene er forhold til kontroll-behandlet cellene.
Siden 1536-brønnen platene er vanlig vev-behandlet plater og ikke hydrogel-belagt eller cellen-frastøtende plater, en begrensning av denne protokollen er bruken av definerte medium, som er en kritisk faktor for vellykket gjennomføring av denne protokollen. KO serum erstatning ble opprinnelig testet for sin evne til å kunne støtte i veksten av embryonale stamceller i 3D17 og i denne protokollen har blitt tilpasset for vekst i mange svulst spheroid linjene13,15, 18 , 19. å merke seg er at selv om media forholdene er ulike veksten av 2D celler mot 3D spheroids, vi har tidligere vist at differensial virkningene av stoffet følsomhet er formidlet av vekst-format, og ikke bare forskjellene i media komposisjon9.
For å lykkes med denne protokollen, som et feilsøkingstrinn, foreslås det en rekke analysen utvikling eksperimenter utføres først for å optimalisere hver celle linje før embarking på en stor skjerm. I dette eksemplet ble alle cellelinjer assayed først vurdert for å avgjøre om de kan bli sådd på samme Start tettheten av 500 celler per brønn. De var så assayed med DMSO bare plater å undersøke standardavvik (SD) og koeffisientene avvik (CVs) for varigheten av vekstperioden. Selv med denne analysen utviklingen i stedet, bestemte linjer vokste raskere enn andre, og det ville ha vært gunstig for videre optimere seeding tettheter og varigheten av eksperimentet av disse mer utfordrende linjene. Til slutt viser dataene som presenteres her at det er en tendens, i stedet for et universelt fenomen, for bestemte linjer som NSCLC linje Calu-6 å være unikt mer følsomme for forbindelser målretting MAPK veien i 3D sammenlignet med de dyrket i 2D. Flere eksperimenter er underveis for å bestemme hva biologiske mekanismer kan bidra til å regulere denne slående forskjellen i følsomhet.
Muligheten til å skjermen spheroids i en ultra-HTS-innstillingen lar 3D kulturer skal brukes tidlig i stoffet funnet prosess og kan aktiverer identifisering av romanen kjemiske saken som bare er aktiv i en 3D. Med kan så mange klinisk kandidater aldri nådde markedet på grunn av effekt hos pasienter, men demonstrere vekst hemming i vitro og regresjon i vivo, lag har startet avhør om implementere 3D Søk bygge bro tidligere under oppdagelsesprosessen. En rekke forskjellige plate typer finnes kultur celler i 3D ved 96-brønnen eller 384-og metoder. Her har vi presentert 1536-og metoder som produserer flere fokus på individuelle spheroids. I fremtiden, kan disse funnene sammenlignes lignende skjermer bruker ny teknologi under utvikling som 1536-vel plater som kan vokse celler som hengende dråper eller plater som er belagt med hydrogel/Matrigel og som er runde-bunnen, som ville tillate for dannelsen av en kule per brønn. Disse forholdene vil introdusere flere lag med kompleksitet til kultur betingelsene brukes for screening, gjør dem enda mer fysiologisk relevant, og kan representere potensielt en økt rate av oversettelse fra benken til sengen for romanen terapier. Disse teknologiene ville også muliggjøre vitenskapelige spørsmål som involverer hypoksi eller spredning graderinger, som krever bruk av større spheroids.
Metodene presenteres her fokus på screening disse spheroids mot et lite molekyl bibliotek av forbindelser. I fremtiden, kan disse metodene utvide til skjermen for romanen biologics og biotherapeutics som bi-spesifikke antistoffer eller antistoff-stoff conjugates, der 3D kulturer kan gi mer fysiologisk relevante antistoff-antigen interaksjoner. I tillegg kan bruken av 3D spheroids være avgjørende for å utvikle sykdommen relevante analyser for forståelse mål og tiltak i den nye immuno-onkologi plass21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansatte i Novartis, og noen ansatte er også aksjonærer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Marc Ferrer ved National Center for fremme translasjonsforskning Sciences, National Institutes of Health for hans støtte og veiledning om den første utviklingen av disse analyser. I tillegg vil vi gjerne takke Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling og Vesselina Cooke for sine vitenskapelige inngang og diskusjon som gruppemedlemmer.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
Consumables | |||
Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
Equipment | |||
Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
Spinning Incubator | LiCONiC | ||
Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).