Er is een belangrijke donor van lever tekort, en criteria voor lever donoren hebben uitgebreid. Normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) is ontwikkeld om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. Deze studie toont een model van de rat van NEVLP en test het vermogen van gepegyleerde-katalase, te verzachten lever behoud letsel.
Er is een significant tekort aan lever allografts beschikbaar voor transplantatie, en naar aanleiding van de donor-criteria hebben uitgebreid. Dientengevolge, is normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. NEVLP heeft vele voordelen in vergelijking met hypothermic en behoud schade, herstel van de normale orgaanfunctie onder fysiologische omstandigheden, evaluatie van de prestaties van het orgel, en als een platform voor orgel reparatie subnormothermic perfusie inclusief verlaagd , remodelleren, en wijziging. Zowel varkens als lymfkliertest NEVLP modellen zijn beschreven. We tonen een rat model van NEVLP en dit model gebruiken een van de belangrijke toepassingen — het gebruik van een therapeutische molecuul aan lever perfusaat toegevoegd. Katalase is een endogene reactieve zuurstof soorten (ROS) scavenger en heeft aangetoond dat verlagen van ischemie-reperfusie in de ogen, hersenen en longen. Pegylation heeft aangetoond dat target katalase aan het endotheel. Hier, we gepegyleerde-katalase (PEG-kat) toegevoegd aan de basis perfusaat en zijn capaciteit te verminderen lever behoud schade aangetoond. Een voordeel van ons knaagdier NEVLP model is dat het is goedkoop in vergelijking met grotere diermodellen. Een beperking van deze studie is dat het op dit moment niet na perfusie levertransplantatie omvat. Daarom niet de voorspelling van de functie van de na orgaantransplantatie met zekerheid worden gemaakt. Echter de rat levertransplantatie model is reeds lang gevestigd en zeker kan worden gebruikt in combinatie met dit model. Kortom, laten wij een goedkoop, eenvoudig, gemakkelijk repliceerbaar NEVLP model met behulp van ratten. Toepassingen van dit model kunnen opnemen testen roman perfusates en perfusaat additieven, testen software ontworpen voor orgel evaluatie en experimenten ontworpen om te herstellen van de organen.
Er zijn 14,578 patiënten op de wachtlijst voor levertransplantatie en ongeveer 7.000 transplantaties worden uitgevoerd per jaar1,2. In antwoord op dit belangrijke donor tekort, hebben de criteria voor donors van de lever uitgebreid; deze worden vaak aangeduid als marginale organen of uitgebreide criteria donoren en moeten presteren minder goed na de transplantatie dan standaardcriteria allografts, met hogere tarieven van primaire graft dysfunctie en vertraagde graft functie3, 4,5,6. Dientengevolge, is NEVLP ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgel functie6,7. Wij hebben ontworpen een rat model van NEVLP en dit model gebruikt om aan te tonen een van zijn belangrijke potentiële toepassingen-het testen van nieuwe molecuul toevoegingsmiddelen lever perfusaat.
NEVLP is beoordeeld in zowel RattenUitrustingen (rat) en varkens modellen, alsmede in afgedankte menselijke organen6,8,9. De resultaten van de eerste menselijke proeven van NEVLP zijn ook onlangs gepubliceerd10. Hoewel hypothermic machine perfusie duidelijk dat de standaard voor het behoud van de nier geworden is, is de temperatuur bij welke lever machine perfusie plaatsvindt nog steeds omstreden. NEVLP heeft veel voorgestelde voordelen in vergelijking met hypothermic en subnormothermic perfusie. Hierbij verminderde behoud schade, herstel van de normale orgaanfunctie onder fysiologische omstandigheden, de mogelijkheid om te beoordelen van de prestaties van het orgel, en als een platform voor orgel reparatie, verbouwing en wijziging7,11, 12,13,14,15,16,17.
Een aanzienlijk aantal studies hebben voltooid met behulp van varkens NEVLP modellen. Hoewel deze modellen relatief goedkope zijn wanneer overweegt modellen met behulp van menselijke organen of menselijke klinische proeven verwijderd, zijn ze erg duur in vergelijking met onze kleine diermodel NEVLP. Een belangrijk onderdeel van de per experiment kosten is het perfusaat. Wij zijn in staat om te voltooien een 4 h perfusie met 300 mL van perfusaat tegen een relatief lage prijs. Bovendien, is de kosten van kleine dieren, met inbegrip van ratten erg laag in vergelijking met de kosten van varkens.
In vergelijking met andere modellen van NEVLP bij de rat, de hier gepresenteerde model is relatief eenvoudig te implementeren en heeft een breed scala aan toepassingen. Het perfusie-circuit kan worden gezien in Figuur 1. Het perfusaat begint in het perfusaat reservoir (1), die een dubbelwandige container van het water is. Perfusaat is die door een roller pomp (2) uit het reservoir wordt getrokken en geduwd in een windkessel (3), waarna de oxygenator (4). De oxygenator ligt voor Tegenstroominstallatie gas en stroom perfusaat bieden maximale Gaswisseling. Het perfusaat dan de opbrengst aan verwarming een coil (5) binnen de perfusie-zaal te bewerkstelligen is bij fysiologische temperatuur, en een waterventiel (6) om te voorkomen dat perfusie van luchtbellen er zijn pre-orgel (7) en na orgel (8) monster poorten, waardoor het perfusaat te zijn bemonsterd. Het perfusaat invoert dan de lever via de portal vein canule. De portal vein canule is aangesloten aan de monitor van een druk die grafieken van de waarden op de software van de verzameling van de gegevens. Het perfusaat vervolgens sluit u de lever via de canule IVC en mondt uit in de druk equalizer blok (9). Tot slot, is het perfusaat getrokken uit het blok druk terug door de roller pomp en geleegd in het reservoir. Dit model omvat continue perfusie aan de portal-ader en laat de Pulsatiele stroom aan de hepatische slagader en dialyse gebruikt in sommige andere modellen, die elk een afzonderlijke en aanvullende circuit vereist, maar hebben eerder aangetoond dat geen vereiste9,13.
De toevoeging van een nieuwe therapeutische molecuul aan het perfusaat verkennen, kozen we voor het enzym katalase. Katalase is een endogene ROS straatveger, die deel uitmaakt van de interne afweermechanisme van cellen om de effecten van ROS18te verminderen. Katalase expressie wordt verhoogd van hepatische ischemie-reperfusie letsel19. Experimentele toevoeging van katalase heeft aangetoond dat verlagen van ischemie-reperfusie in de ogen, hersenen en longen20,21,22,23,24. Pegylation heeft aangetoond dat target katalase op het endotheel en de steun bij katalase opname in de endotheliale cellen25. PEG-CAT is systemisch toegediend met beperkte doeltreffendheid bij het verminderen van hepatische ischemie-reperfusie letsel; echter veronderstelde we dat het toevoegen van DAT PEG-CAT aan een geïsoleerde orgel perfusie circuit zou leiden tot betere26,27,28 resultaten. Hier, we PEG-CAT toevoegen aan onze basis perfusaat en laten zien dat haar lever behoud schade beperken.
Er is een significant tekort aan lever allografts beschikbaar voor transplantatie en reactie donor criteria zijn uitgebreide1,2,3,4,5. Als gevolg van de tekort van de donor, is NEVLP ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgel functie6,7. Wij hebben ontworpen een rat model van NEVLP…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NIH T32AI 106704-01A1 en het T. Flesch Fonds voor orgaantransplantatie, perfusie, Engineering en regeneratie aan The Ohio State University.
Perfusate | |||
8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
Personal Protective Equipment | |||
Surgical Mask | Generic | N/A | |
Protective Gown | Generic | N/A | |
Surgical Gloves | Generic | N/A | |
Liver Procurement | |||
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
Liver Perfusion Circuit Components | |||
Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
Microsurgical Instruments | |||
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
Post-Experiment Analysis | |||
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |