Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии
Summary
Существует нехватка значительной донорской печени, и были расширены критерии для печени доноров. Нормотермических ex vivo печени перфузии (NEVLP) был разработан для оценки и изменения функции органа. Это исследование демонстрирует модель крыса NEVLP и проверяет способность Пегилированный каталазы, для уменьшения травмы печени сохранения.
Abstract
Существует значительный дефицит печени аллотрансплантация тканей для трансплантации, а в ответ были расширены критерии доноров. В результате была введена нормотермических ex vivo печени перфузии (NEVLP) как метод для оценки и изменения функции органа. NEVLP имеет много преимуществ по сравнению с гипотермического и subnormothermic перфузии включая снижение сохранения травмы, восстановление нормальной орган функции в физиологических условиях, оценки производительности орган и как платформа для ремонта орган , ремонт и модификации. Были описаны мышиных и свиные NEVLP модели. Мы продемонстрировать мышиной модели NEVLP и использовать эту модель, чтобы показать один из его важных приложений — использование терапевтические молекулы, добавлен в печени perfusate. Каталаза является мусорщик эндогенного реактивнооксигенных видов (ров) и продемонстрировал снижение ишемии реперфузии в глаз, головного мозга и легких. Было показано, что ПЭГилирование целевой каталазы эндотелия. Здесь, мы добавили Пегилированный каталазы (PEG-CAT) в базу perfusate и продемонстрировала свою способность смягчения травмы печени сохранения. Преимуществом нашей грызунов NEVLP модели является недорогой по сравнению с более крупных животных моделей. Ограничение этого исследования является, что она не включает в настоящее время пересадки печени после перфузии. Таким образом прогнозирование функции после пересадки нельзя сделать с уверенностью. Однако модель трансплантации печени крысы хорошо известна и безусловно могут быть использованы в сочетании с этой моделью. В заключение мы продемонстрировали недорогой, простой, легко воспроизводимые NEVLP модель, с помощью крыс. Применение этой модели может включать тестирование Роман перфузатов и perfusate добавки, тестирования программного обеспечения, предназначенного для оценки орган и экспериментов, предназначенные для ремонта органов.
Introduction
Есть 14,578 больных в листе ожидания для трансплантации печени и приблизительно 7.000 пересадки выполняются за год1,2. В ответ на этой нехватки доноров расширили критерии для печени доноров; они часто называют маргинальных органов или расширенные критерии доноров и, как ожидается, для выполнения менее хорошо после трансплантации, чем стандартные критерии аллотрансплантантов, с более высокими ставками первичных трансплантата дисфункции и задержки трансплантата функция3, 4,5,6. В результате NEVLP была введена как метод для оценки и изменения функции органа6,7. Мы разработали модель крыса NEVLP и использовал эту модель для демонстрации одной из ее важных потенциальных – тестирование приложений Роман молекулы добавок к печени perfusate.
NEVLP был оценен как Мурина (Крыса), так и свинину модели, а также в брошенные человеческие органы6,8,9. Результаты первого испытания на человеке NEVLP были также недавно опубликованный10. Хотя явно гипотермического машина перфузии стал стандартом для сохранения почек, температура, при которой печени машина должна происходить перфузии остается спорным. NEVLP имеет много предлагаемые преимущества по сравнению с гипотермического и subnormothermic перфузии. К ним относятся сокращение сохранения травмы, восстановление нормальной орган функции в физиологических условиях, возможность оценить производительность орган и как платформа для органа ремонта, реконструкции и модификации7,11, 12,13,14,,1516,17.
Значительное количество исследований были завершены с использованием свиных NEVLP моделей. Хотя эти модели являются сравнительно недорогой, при рассмотрении модели с помощью органов человека или клинические испытания на человеке, они являются очень дорогими по сравнению с нашей небольшой животных NEVLP модели. Важным компонентом в эксперимент стоит perfusate. Мы в состоянии выполнить 4 h перфузии с 300 мл perfusate при относительно низких затратах. Кроме того стоимость мелких животных, включая крысы является очень низким по сравнению со стоимостью свиней.
По сравнению с других моделей NEVLP в крыса модель, представленная здесь относительно прост в реализации и имеет широкий спектр применения. Перфузии цепи можно увидеть на рисунке 1. Perfusate начинается в perfusate водохранилище (1), который является контейнером с рубашкой воды. Perfusate вытащил из водохранилища с помощью валика насоса (2) и толкнул в windkessel (3), а затем Оксигенатор (4). Оксигенатор устанавливается противоточный газа и perfusate потока для обеспечения максимальной газообмена. Perfusate затем приступает к Отопление катушки (5) внутри камеры перфузии для обеспечения его физиологического температуре, и Пузырь ловушки (6) для предотвращения перфузии пузырьков воздуха там до органа (7) и после органа (8) образца порты, которые позволяют perfusate быть пробы. Perfusate затем поступает через канюлю воротной вены печени. Канюля воротной вены прилагается к давление монитор, что диаграммы значения на программное обеспечение сбора данных. Perfusate затем выходит из печени через канюлю МКВ и впадает в блоке эквалайзер давления (9). Наконец perfusate вытащил из блока давления обратно через насос ролик и опорожняется в водохранилище. Эта модель включает в себя непрерывное перфузии в воротной вены и оставляет пульсирующего поток печеночной артерии и диализа, используемых в некоторых других моделей, каждая из которых требует отдельного и дополнительного цепи, но показали, ранее, чтобы не быть необходимые9,13.
Чтобы исследовать дополнение Роман терапевтические молекулы perfusate, мы выбрали фермента каталазы. Каталаза является эндогенного мусорщик ROS, которая является частью клетки внутренней обороны механизма для смягчения последствий ROS18. Каталаза выражение увеличение печени ишемии реперфузионных повреждений19. Для уменьшения ишемии реперфузии в глаз, головного мозга и легких20,21,22,,2324была продемонстрирована экспериментальная дополнением каталазы. Было показано, что ПЭГилирование целевой каталазы в эндотелия и помощь в освоении каталазы в эндотелиальных клеток25. ПЭГ-CAT находится под управлением системно, с ограниченной эффективности в снижении печеночная ишемии реперфузии травмы; Однако мы предположили, что добавление PEG-CAT к цепи перфузии изолированной органа приведет к улучшению результатов26,27,28. Здесь, мы добавляем PEG-CAT для нашей базы perfusate и продемонстрировать его способности смягчить травмы печени сохранения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует значительный дефицит печени аллотрансплантация тканей для трансплантации, и в ответ критерии доноров были Расширенный1,2,3,4,5. В результате нехватки доноров была введена NEVLP как метод для…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана низ T32AI 106704-01A1 и т. показатель удобочитаемости Flesch фонд для трансплантации, перфузии, инженерные и регенерации в университете штата Огайо.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
