Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo
Summary
Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.
Abstract
Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante, y en respuesta se han ampliado los criterios de los donantes. Como resultado, perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función del órgano. NEVLP tiene muchas ventajas en comparación con hipotermia y subnormothermic perfusión incluyendo reduce lesiones de preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, evaluación de funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos , remodelación y modificación. Modelos NEVLP murinos y porcinos se han descrito. Nos muestran un modelo de rata de NEVLP y utilizar este modelo para mostrar una de sus importantes aplicaciones, el uso de una molécula terapéutica añadida a la solución de hígado. La catalasa es un limpiador de endógeno reactivas del oxígeno (ROS) las especies y se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio. Aquí, hemos añadido pegilado-catalasa (PEG-CAT) a la solución base y demostrado su capacidad para mitigar la lesión hepática de preservación. Una ventaja de nuestro modelo NEVLP roedor es que es barato en comparación con los modelos animales más grandes. Una limitación de este estudio es que actualmente no incluir perfusión después del trasplante del hígado. Por lo tanto, la predicción de la función del post-trasplante de órganos no se puede realizar con certeza. Sin embargo, el modelo de trasplante de hígado de rata está bien establecido y ciertamente podría ser utilizado en conjunción con este modelo. En conclusión, hemos demostrado un modelo NEVLP barato, simple y fácilmente replicable con ratas. Las aplicaciones de este modelo pueden incluir pruebas de perfusates novela y aditivos de la solución, prueba software diseñado para la evaluación del órgano y experimentos diseñados para reparar órganos.
Introduction
Hay 14.578 pacientes en lista de espera para el trasplante hepático y aproximadamente 7.000 trasplantes se realizan por año1,2. En respuesta a esta escasez de donantes importantes, se han ampliado los criterios de los donantes de hígado; Estos se refieren a menudo como órganos marginales o donantes criterios extendidos y se esperan que realice menos bien después del trasplante de aloinjertos de criterios estándar, con tasas mayores de disfunción primaria del injerto y de la función retardada del injerto3, 4,5,6. Como resultado, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rata de NEVLP y utiliza este modelo para demostrar uno de sus potenciales aplicaciones importantes – las pruebas de aditivos de la novedosa molécula a solución de hígado.
NEVLP se ha evaluado en modelos porcinos y murino (rata), así como en órganos humanos desechados6,8,9. Los resultados de los primeros ensayos humanos de NEVLP recientemente han sido publicados10. Aunque la perfusión hipotérmica de la máquina se ha convertido claramente en el estándar para la preservación del riñón, la temperatura en que máquina hígado ocurre perfusión es aún controversial. NEVLP tiene muchas ventajas propuestas en comparación con hipotermia y perfusión de subnormothermic. Estos incluyen lesión menor preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, la capacidad para evaluar el funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos, remodelación y modificación7,11, 12,13,14,15,16,17.
Se han completado un número significativo de estudios utilizando modelos NEVLP porcinos. Aunque estos modelos son comparativamente baratos teniendo en cuenta modelos descartados los órganos humanos o ensayos clínicos en humanos, son muy caros en comparación con nuestro modelo NEVLP animal pequeño. Un componente significativo de la por experimento costo es la solución. Somos capaces de terminar una perfusión de 4 h con 300 mL de solución a un costo relativamente bajo. Además, el costo de pequeños animales tales como ratas es muy bajo en comparación con el costo de los cerdos.
En comparación con otros modelos de NEVLP en la rata, el modelo presentado aquí es relativamente fácil de implementar y tiene una amplia gama de aplicaciones. El circuito de perfusión puede verse en la figura 1. La solución comienza en el depósito de la solución (1), que es un recipiente con camisa de agua. Solución es extraído del depósito por una bomba de rodillos (2) y empujó en un windkessel (3) y, a continuación, el oxigenador (4). El oxigenador se encuentra gas a contracorriente y flujo de la solución para proporcionar intercambio gaseoso máximo. La solución entonces procede a un calentamiento de la bobina interior (5) la cámara de perfusión para asegurarse de que está a temperatura fisiológica, y una trampa de burbujas (6) para evitar la perfusión de burbujas de aire que son pre-órgano (7) y post-órgano (8) puertos de la muestra, que permiten la solución a ser muestreadas. La solución entonces entra en el hígado a través de la cánula de la vena porta. La cánula de la vena porta está conectada a un monitor de presión que traza los valores en el software de colección de datos. La solución entonces sale del hígado a través de la cánula de la vena cava inferior y desemboca en el bloque de ecualizador de presión (9). Finalmente, la solución es extraída el bloque de presión por la bomba de rodillo y vaciar en el depósito. Este modelo incluye una perfusión continua a la vena porta y deja fuera el flujo pulsátil de la arteria hepática y la diálisis en algunos otros modelos, cada uno de ellos requiere un circuito independiente y adicional, pero anteriormente se han demostrado para no ser requiere9,13.
Para explorar la adición de una molécula terapéutica novedosa para la solución, optamos por la enzima catalasa. La catalasa es un limpiador ROS endógeno que participa en el mecanismo interno de defensa de las células para mitigar los efectos de ROS18. Expresión de catalasa se incrementa en hepática isquemia reperfusión lesiones19. Experimental además de catalasa se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón20,21,22,23,24. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio y ayuda en la absorción de catalasa en las células endoteliales25. PEG-CAT se ha administrado sistémicamente con limitada eficacia en la reducción de lesión de la isquemia-reperfusión hepática; sin embargo, la hipótesis de que añadir QUE PEG-CAT a un circuito de perfusión de órgano aislado conduciría a mejores resultados26,27,28. Aquí, añadimos PEG-CAT a nuestra solución base y demostrar su capacidad de mitigar la lesión hepática de preservación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante y en respuesta criterios de donante han ampliado1,2,3,4,5. Como consecuencia de la escasez de donantes, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH T32AI 106704-01A1 y T. Flesch fondo para trasplante de órganos, la perfusión, ingeniería y regeneración en la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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