Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル
1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center,Ohio State University Wexner Medical Center, 2Department of Surgery, Division of Transplant,Ohio State University Wexner Medical Center, 3Department of Surgery, Division of CardioThoracic Surgery,Ohio State University Wexner Medical Center, 4Department of Medicine,Ohio State University Wexner Medical Center
Summary
重要な肝ドナー不足があるし、肝ドナーの条件が展開されています。常温体外肝灌流 (NEVLP) は評価し臓器の機能を変更しました。本研究は NEVLP のモデルラットを示します、保存肝傷害を軽減するために、ペグインターフェロン カタラーゼの機能をテストします。
Abstract
移植、肝移植の重要な不足があるし、応答ドナー条件が展開されています。その結果、常温体外肝灌流 (NEVLP) は、評価および器官の機能を変更する方法として導入されています。低体温と比較して多くの利点があり、保全傷害、評価、オルガンとオルガンの修理のためのプラットフォームとして生理学的条件下で正常臓器機能の回復を削減 subnormothermic 灌流を含む NEVLP、、改造、変更。マウスおよびブタの NEVLP モデルが記載されています。NEVLP のラット モデルの実証を行い, このモデルを使用して、重要なアプリケーションの 1 つを表示 — 肝出納に追加治療の分子の使用。カタラーゼは内因性活性酸素種 (ROS) のスカベン ジャーを目、脳、肺の虚血再灌流の減少が示されています。Peg 修飾操作は、内皮細胞にカタラーゼをターゲットに示されています。基本の出納にペグインターフェロン カタラーゼ (ペグ猫) を追加しましたここでは、保存肝傷害を軽減するためにできることを示したとします。齧歯動物 NEVLP モデルの利点はより大きい動物モデルと比較すると高価です。本研究の限界は、現在後灌流肝移植を含まないことです。したがって、臓器移植後の機能の予測は、確実に出来ません。しかし、ラット肝移植モデルはよく確立されて、確かにこのモデルと組み合わせて使用することができます。結論としては、ラットを用いた安価な簡単な容易に複製可能な NEVLP のモデルを示しています。このモデルのアプリケーションは、新規 perfusates と出納添加物、テスト機関評価のために設計されたソフトウェアならびに臓器を修復するように設計実験を含めることができます。
Introduction
約 7,000 の移植が行われる年1,2あたりと肝移植の順番待ちリストに 14,578 患者があります。この重要なドナー不足に対し、肝ドナーの条件を拡大しています。これらはしばしば限界器官または拡張条件ドナーと呼びます、主な移植臓器機能不全の遅延移植機能3、率の高い、標準的な基準移植よりも移植後あまりに実行すると予想 4,5,6。その結果、NEVLP は、評価および器官機能6,7を変更するメソッドとして導入されています。NEVLP のモデルラットを設計し、肝出納に分子添加剤のテスト – 重要な潜在的なアプリケーションの 1 つであるこのモデルを使用します。
マウス (ラット) の豚のモデルだけでなく、捨てられた人間の臓器6,8,9の NEVLP を評価されています。NEVLP の最初の人間の臨床試験の結果はまた、最近公開された10をされています。低体温機械灌流腎保存のための標準となっている明確に、どの肝機械灌流が発生する温度はまだ論争を呼びます。NEVLP は低体温と比較して多くの提案された利点と subnormothermic 血流。縮小保存傷害、オルガンのパフォーマンスを評価するために能力の生理学的条件下で、オルガンの修理、改造、および変更7,11のためのプラットフォームとしての正常臓器機能の回復が含まれます 12,13,14,15,16,17。
研究のかなりの数は、ブタの NEVLP モデルを使用して完了しています。人間の臓器やひと臨床試験使用を考慮したモデルが破棄されたときこれらのモデルは比較的高価な小さな動物 NEVLP モデルに比べて非常に高価です。重要なコンポーネント、実験コストが至る。比較的低コストで出納の 300 mL で 4 時間灌流を完了しております。また、ラットなどの小動物のコストは豚のコストと比較して非常に低いです。
ラットにおける NEVLP の他のモデルと比較してここに提示されたモデルは比較的簡単に実装、アプリケーションの広い範囲。灌流回路は、図 1に見ることができます。液は水ジャケット コンテナーである出納貯水池 (1) で起動します。出納はローラー ポンプ (2) 貯水池から引かれウインドケッセル (3) と (4) 肺に押されています。つとめては向流ガスの流量最大ガス交換を提供するために設定されます。出納し、加熱が進み、コイルを確認して灌流チェンバは、生理学的温度 (5) 内部と空気の泡が血流を防ぐためにバブル トラップ (6)、前のオルガン (7) 後オルガン (8) 許可する出納サンプル ポートサンプリング。至る門脈カニューレを介して肝臓に入ります。門脈カニューレは、データ収集ソフトウェアの値をチャートの圧力モニターにアタッチされます。液は下大静脈カニューレを介して肝臓を終了し、圧力・ イコライザ ・ ブロック (9) に流れ込みます。最後に、液はローラー ポンプを通って圧力ブロックからプル、貯水池に空に。このモデル門脈持続灌流が含まれていますと肝動脈およびそれぞれは別々 と追加回路を必要とするいくつかの他のモデルで使用されている透析に拍動流を残しますが、以前はできませんが示されています。必要な9,13。
治療上の分子の付加を出納、探検するには、酵素カタラーゼを選びました。カタラーゼは活性酸素18の効果を軽減するために細胞内部防衛機構の一部である内因性の活性酸素スカベン ジャーです。カタラーゼの発現は肝虚血再灌流傷害19で増加します。カタラーゼの実験的付加は、目、脳、肺20,21,22,23,24虚血再灌流の減少を実証されています。Peg 修飾操作は、内皮細胞25に内皮細胞とカタラーゼの吸収の援助にカタラーゼをターゲットに示されています。ペグ猫は、肝虚血再灌流傷害; を減らすに限られた有効性と全身投与されています。ただし、我々 を追加分離臓器灌流回路にペグ猫は改善につながる結果26,27,28であること仮定しました。私たちの基本の出納にペグ猫を追加ここでは、その能力を発揮し、保存肝傷害を軽減。
Protocol
機関動物ケアのガイドラインに従ってすべての手順を行ったしてオハイオ州立大学 IACUC 委員会による承認を受けている国家研究評議会の人道的なケアと実験動物の使用 (IACUC) のためのガイド。 1. 初期設定 次を組み合わせることにより灌流液を準備: 25% アルブミンの 86 mL、ウィリアムズのメディアの 184 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン (10 U/mL 0.01 mg/mL と…
Representative Results
グループごとの 3 つのラットのサンプル サイズが使用されました。Alt キーは 0、30、60、90、120、150、180、210、および灌流の 240 分で測定しました。学生のtを使いました-基本液と基本出納プラス各時点で PEG 猫のグループ間の結果を比較するテスト。基本出納および基本出納ペグ猫グループを比較すると、そこは大幅に少ない (p < 0.05) 基本出納プラス 240 ?…
Discussion
移植肝移植の重要な不足があるし、応答でドナーの条件は拡張1,2,3,4,5をされています。ドナー不足の結果として、NEVLP は、評価および器官機能6,7を変更する方法として導入されています。我々 は、NEVLP のモデルラットを設計?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、臓器移植、灌流、工学、オハイオ州立大学での再生の NIH T32AI 106704 01A1 と t. フレッシュ基金によって支持されました。
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
Cite This Article
Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J., Akateh, C., Eren, E., Maynard, K., Sen, C. K., Zweier, J. L., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (136), e57541, doi:10.3791/57541 (2018).