Een methode voor het genereren van een Doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie model in volwassen zebravissen (Danio rerio) wordt hier beschreven. Twee alternatieve manieren van intraperitoneale injectie worden gepresenteerd en voorwaarden om de variaties tussen verschillende experimentele groepen worden besproken.
De genetisch toegankelijk volwassen zebravissen (Danio rerio) is steeds meer gebruikt als een gewervelde model voor het begrip van ziekten bij de mens zoals cardiomyopathie. Vanwege haar gemak en inschikkelijkheid tot hoge doorvoer genetische manipulaties, opent de generatie van verworven cardiomyopathie modellen, zoals de Doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC) model in volwassen zebrafish, de deuren naar nieuwe onderzoek wegen, met inbegrip van cardiomyopathie modifiers via voorwaartse genetische screening te ontdekken. Anders dan de embryonale zebrafish DIC model, zowel initiële acute en later chronische fasen van cardiomyopathie kunnen worden bepaald in het volwassen zebrafish DIC model, waardoor de studie van fase-afhankelijke signalering mechanismen en therapeutische strategieën. Echter kunnen variabele resultaten worden verkregen met het huidige model, zelfs in de handen van ervaren onderzoekers. Om te vergemakkelijken de toekomstige uitvoering van de DIC-model, presenteren we een gedetailleerd protocol over het genereren van dit model DIC in volwassen zebravis en beschrijven van twee alternatieve manieren van intraperitoneale injectie van (IP). Verder bespreken we opties over hoe te verminderen variaties voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten en verstrekken suggesties aangaande hoe te op de juiste manier interpreteren van de resultaten.
Doxorubicine (DOX), ook genoemd adriamycine, is ontwikkeld als een anti-neoplastische drug sinds de jaren 19601,2. Het is nu nog steeds actief als een belangrijke chemotherapeutische drug gebruikt voor een breed spectrum van tumoren. Echter, klinische toepassing van DOX werd gehinderd door de dosis-afhankelijke toxicities, met name cardiotoxicity gekenmerkt door variabele symptomen variërend van asymptomatische electrocardiographic wijzigingen tot pericarditis en gedecompenseerde cardiomyopathie 1 , 2. tot op heden, ten minste drie belangrijke hypothesen naar voren zijn gebracht om uit te leggen DIC, met inbegrip van geactiveerde reactieve zuurstof soorten (ROS)1,3,4,5, remming van topoisomerase II-β () 76,TOP2β), en modulatie van intracellulair calcium vrij1,8,9. Vergaren van bewijs suggereert ook genetische aanleg als een belangrijke risicofactor voor DIC10,11,12,13. Gene identiteiten aan deze predisposities DIC gerelateerde blijven echter grotendeels onbekend. Dexrazoxane is de enige adjuvans agent goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor de behandeling van DIC, maar met beperkte uitvoering14,15,16, onderstrepen de noodzaak om te identificeren extra therapeutische strategieën. Dierlijke modellen voor DIC worden daarom onderzocht voor deze doeleinden. Als gevolg van hun toegankelijkheid en eenvoud, mechanistische studies over DIC modellen kon potentieel hebben bredere effecten op andere soorten hartziekten: gemeenschappelijke pathogenese kan worden gedeeld onder hartziekten van andere etiologie, vooral bij later pathologische stadia17,18,19,20.
Naast knaagdier modellen van DIC, zijn zebravis DIC modellen met hogere doorvoer ontwikkeld om de ontdekking van zowel nieuwe genetische factoren en therapeutics. Een embryonale DIC-model is opgezet in de transparante zebrafish embryo’s om therapeutische stoffen21te screenen. Gezien het feit dat de hartziekten volwassen begin ziekten met een progressieve pathogenese zijn, ontwikkeld volwassen zebrafish cardiomyopathie modellen geweest22,23,24,25,26. We genereerden de eerste verworven model voor cardiomyopathie ten gevolge van chronische anemie24, gevolgd door DIC als het tweede model van de verworven cardiomyopathie in volwassen zebrafish23. We vonden dat de injectie van een enkele bolus van DOX in volwassen zebrafish cardiotoxicity die uit een acute fase ongeveer binnen 1 week na injectie (wpi) induceert bestaat, gevolgd door een chronische fase van cardiomyopathie omhoog tot 6 maanden na injectie. Terwijl de haploinsufficiency van het mechanistische streefcijfer van rapamycin(mtor) cardiomyopathie uitzitten in de chronische fase, overdrijft het vis mortaliteit in de acute fase, onderstrepen de waarde van de volwassen DIC-model te onderscheiden van fase-afhankelijke mechanismen23. We verder aangetoond dat de volwassen DIC-model kan worden gebruikt voor het benadrukken van een verzameling van zebravis dat cardiale (ZIC) mutanten die worden gegenereerd via een dat mutagenese transposon gebaseerde aanpak27. Een pilot scherm geïdentificeerd 3 bekende cardiomyopathie genen evenals DnaJ (Hsp40) homolog, onderfamilie B, en lid 6b (dnajb6b) als nieuwe DIC gevoeligheid genen28. Dus, de generatie van de volwassen DIC model in zebrafish leidde tot een nieuwe methodiek waarmee systematisch identificatie van genetische modifiers voor DIC, als aanvulling op de bestaande vereniging van genoom-brede studie (GWAS) en kwantitatieve trait locus (QTL ) analyse.
Tijdens de generatie en de uitvoering van de volwassen zebrafish DIC model, hebben we gemerkt aanzienlijke verschillen tussen verschillende onderzoekers en/of zelfs onder verschillende injecties uitgevoerd door de dezelfde onderzoeker. De longitudinale aard van het model legt uitdagingen om te registreren van de resultaten van verschillende onderzoekers en het sequentiële probleemoplossing proces. Ter vergemakkelijking van het gebruik van deze eenvoudige cardiomyopathie-inducerende stress methode door de onderzoekgemeenschap, we ons protocol in detail, deze twee soorten IP-injectie, beschrijven en bespreken van overwegingen ter vermindering van de variaties tussen verschillende onderzoekers.
Om het model een progressieve DIC, werd de dosis van 20 mg/kg DOX experimenteel als de hoogste dosis die niet leidt significante vis dood tijdens 1 wpi, maar nog steeds resultaten in vis dood en de vermindering van de cardiale functie na 4 wpi (Figuur 3 en tot vastgesteld Figuur 4C). Deze dosis is vergelijkbaar aan de veelvuldig bij knaagdieren DIC modellen (15-25 mg/kg) en aan de cumulatieve limietdosis bij de mens (550 mg/m2, dat overeen met 15 mg/k…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een wetenschapper ontwikkeling subsidie van de American Heart Association (14SDG18160021 naar YD), de Amerikaanse NIH R01 verleent HL 81753 en HL 107304 XX, en de Stichting van de Mayo aan XX.
Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |