Eine Methode zur Erzeugung einer Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie-Modell im Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) wird hier beschrieben. Zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion werden vorgestellt und Bedingungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen werden diskutiert.
Der genetisch zugänglich Erwachsene Zebrabärbling (Danio Rerio) wurde zunehmend als ein Wirbeltier Modell eingesetzt, für das Verständnis menschlicher Erkrankungen wie z. B. Kardiomyopathie. Wegen seiner Bequemlichkeit und Bereitschaft zu hoher Durchsatz genetische Manipulationen öffnet die Generation der erworbenen Kardiomyopathie Modelle, wie Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie (DIC) Modell in Erwachsenen Zebrafisch, die Türen für neue Forschungsansätze, einschließlich Kardiomyopathie Modifikatoren über vorwärts genetisches Screening zu entdecken. Anders als bei der embryonalen Zebrafisch-DIC-Modell, Initiale akute und später chronische Phasen der Kardiomyopathie kann im Erwachsenen Zebrafisch DIC Modell ermöglicht die Untersuchung der Bühne-abhängige Signalisierung Mechanismen und therapeutische Strategien bestimmt werden. Allerdings erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse mit dem aktuellen Modell, auch in den Händen von erfahrenen Ermittlern. Um zukünftige Umsetzung des DIC-Modells zu erleichtern, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zum Generieren dieser DIC-Modell im Erwachsenen Zebrafisch und zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion (IP) zu beschreiben. Wir diskutieren weiter Optionen zur Verringerung der Varianten, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und geben Anregungen, wie Sie die Ergebnisse richtig zu interpretieren.
Doxorubicin (DOX), auch benannt Adriamycin, wurde als “Anti-neoplastische Drug” seit den 1960er Jahren1,2entwickelt. Es ist jetzt noch aktiv als eine wichtige Chemotherapeutikum für ein breites Spektrum von Tumoren eingesetzt. Doch klinische Anwendung der DOX wurde erschwert durch die dosisabhängige Toxizität, insbesondere Kardiotoxizität zeichnet sich durch Variable Symptome von asymptomatischen elektrokardiographischen Veränderungen bis hin zu Perikarditis und dekompensierter Kardiomyopathie 1 , 2. bisher mindestens drei wichtige Hypothesen um zu erklären, DIC, einschließlich aktivierter reaktive Sauerstoff Spezies (ROS)1,3,4,5, Hemmung der Topoisomerase II-β (angehoben worden TOP2β)6,7und Modulation von intrazellulären Calcium release1,8,9. Beweise sammeln, schlägt auch genetischen Veranlagung als entscheidender Risikofaktor für DIC10,11,12,13. Bleiben Sie gen Identitäten im Zusammenhang mit diesen DIC Prädispositionen, jedoch weitgehend unbekannt. Dexrazoxan ist der einzige adjuvante Agent genehmigt durch die US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von DIC, aber mit begrenzten Umsetzung14,15,16, unterstreicht die Notwendigkeit, zusätzliche identifizieren therapeutische Strategien. Tiermodelle der DIC sind daher für diese Zwecke erforscht. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit und Einfachheit, mechanistische Studien auf DIC Modelle könnte haben breitere Auswirkungen auf andere Arten von Kardiomyopathien: gemeinsame Pathogenese kann gemeinsam genutzt werden Kardiomyopathien der verschiedenen Ätiologien, vor allem bei später pathologischen Stadien17,18,19,20.
Neben der Nager-Modelle von DIC entwickelten Zebrafisch DIC Modelle mit höheren Durchsatz um die Entdeckung der neuen genetischen Faktoren und Therapeutika zu erleichtern. Eine embryonale DIC-Modell wurde in den transparenten Zebrafish Embryos für das screening von therapeutischen Substanzen21eingerichtet. Angesichts der Tatsache, dass der Kardiomyopathien Altersdiabetes Krankheiten mit einer progressiven Pathogenese, entwickelt Erwachsenen Zebrafisch Kardiomyopathie Modelle wurden22,23,24,25,26. Wir erzeugt das erste erworbene Modell für Kardiomyopathie infolge chronischer Anämie24, gefolgt von DIC als das zweite Modell der erworbenen Kardiomyopathie in Erwachsenen Zebrafisch23. Wir fanden, dass die Injektion eines einzigen Bolus von DOX in Erwachsenen Zebrafisch Kardiotoxizität induziert, die aus einer akuten Phase etwa innerhalb 1 Woche nach der Injektion (Wpi), gefolgt von einer chronischen Phase der Kardiomyopathie bis zu 6 Monate nach der Injektion besteht. Während Haploinsufficiency des mechanistischen Ziel von Rapamycin(Mtor) bessert Kardiomyopathie in der chronischen Phase, übertreibt es Fischsterblichkeit in der Akutphase unterstreicht den Wert der Erwachsenen DIC-Modells, Bühne-abhängige zu erkennen Mechanismen23. Wir zeigten weiter, dass die Erwachsenen DIC-Modell verwendet werden kann, auf eine Sammlung von Zebrafisch insertional kardiale (ZIC) Mutanten hinweisen, die über ein Transposon-basierte insertional Mutagenese Ansatz27generiert werden. Ein pilot Bildschirm identifiziert 3 bekannten Kardiomyopathie Gene sowie DnaJ (hps40) Homolog, Unterfamilie B und Mitglied 6 b (dnajb6b) als neue DIC Anfälligkeit Gene28. Daher führte die Generation der Erwachsenen DIC-Modells im Zebrafisch, eine neue Methodik, die systematisch ermöglicht die Identifizierung der genetischen Modifikatoren für DIC, ergänzt die bestehenden genomweite Studie (GWAS) und quantitative Trait Locus (QTL ) Analyse.
Während der Generierung und Implementierung des Erwachsenen Zebrafisch-DIC-Modells haben wir erhebliche Abweichungen zwischen den verschiedenen Wissenschaftlern und/oder auch unter den verschiedenen Injektionen durchgeführt durch den gleichen Prüfer festgestellt. Die longitudinale Natur des Modells erlegt Herausforderungen für Registrierung Ergebnisse von verschiedenen Forschern und der sequentiellen Problembehandlungsprozess. Um die Verwendung dieser einfachen Kardiomyopathie-induzierende Stress-Methode durch die Forschungsgemeinschaft zu erleichtern, wir beschreiben unser Protokoll detailliert vorliegenden zwei Arten von IP-Injektion und Überlegungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Forschern zu diskutieren.
Um eine progressive DIC zu modellieren, wurde die Dosis von 20 mg/kg DOX experimentell als die höchste Dosis ermittelt, die keine signifikante Fisch Tod während 1 Wpi, aber immer noch die Ergebnisse im Fisch Tod und die Verringerung der Herzfunktion nach 4 Wpi (Abbildung 3 und verursacht Abbildung 4). Diese Dosis ist vergleichbar mit denen häufig in Nager DIC-Modelle (15-25 mg/kg) und der Grenze kumulative Dosis beim Menschen (550 mg/m2, das entspr…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise von einem Wissenschaftler Development Grant von der American Heart Association unterstützt (14SDG18160021, YD), die USA NIH R01 gewährt HL 81753 und HL 107304 XX und der Mayo Foundation bis XX.
Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |