वयस्क Zebrafish में एक डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित Cardiomyopathy मॉडल
Summary
वयस्क zebrafish (ढाणियो rerio) में एक डॉक्सोरूबिसिन प्रेरित cardiomyopathy मॉडल उत्पंन करने के लिए एक विधि यहां वर्णित है । intraperitoneal इंजेक्शन के दो वैकल्पिक तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच बदलाव को कम करने के लिए शर्तें चर्चा कर रहे हैं ।
Abstract
आनुवंशिक रूप से सुलभ एडल्ट zebrafish (ढाणियो rerio) को cardiomyopathy जैसे मानव रोगों को समझने के लिए एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में प्रयोग तेजी से किया गया है । क्योंकि अपनी सुविधा और उच्च प्रवाह आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए, इस तरह के डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित cardiomyopathy (उद्योग) वयस्क zebrafish में मॉडल के रूप में अधिग्रहीत cardiomyopathy मॉडल, की पीढ़ी, नए अनुसंधान के रास्ते के लिए दरवाजे खोल रही है, आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग के माध्यम से खोज cardiomyopathy संशोधक सहित । भ्रूण zebrafish उद्योग मॉडल से अलग, दोनों प्रारंभिक तीव्र और बाद में cardiomyopathy के पुराने चरणों वयस्क zebrafish उद्योग मॉडल में निर्धारित किया जा सकता है, मंच के अध्ययन पर निर्भर संकेतन तंत्र और चिकित्सीय रणनीतियों को सक्षम करने से । हालांकि, चर परिणाम मौजूदा मॉडल के साथ अनुभवी जांचकर्ताओं के हाथों में भी प्राप्त किया जा सकता है । के लिए उद्योग मॉडल के भविष्य के कार्यांवयन की सुविधा, हम कैसे वयस्क zebrafish में इस उद्योग मॉडल उत्पंन करने के लिए और intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन के दो वैकल्पिक तरीके का वर्णन पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । हम आगे कैसे रूपांतरों को कम करने के लिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने और कैसे उचित परिणाम की व्याख्या करने पर सुझाव देने पर विकल्पों पर चर्चा की ।
Introduction
डॉक्सोरूबिसिन (DOX), भी Adriamycin नाम, 1960 के दशक के बाद से एक विरोधी नवोत्पादित दवा के रूप में विकसित किया गया है1,2. यह अब भी सक्रिय रूप से ट्यूमर का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए एक महत्वपूर्ण कीमोथेरेपी दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, DOX के नैदानिक आवेदन अपनी खुराक पर निर्भर विषाक्तता, विशेष रूप से चर स्पर्शोन्मुख electrocardiographic परिवर्तन से pericarditis और क्षतिपूर्ति cardiomyopathy से लेकर लक्षण द्वारा विशेषता के द्वारा बाधा उत्पंन किया गया था cardiotoxicity 1 , 2. तारीख करने के लिए, सक्रिय प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)1,3,4,5, चतुर्थ तोपोइसोमेरसे द्वितीय के निषेध सहित, कम से कम तीन प्रमुख परिकल्पनाओं को उद्योग की व्याख्या करने के लिए उठाया गया है-β ( TOP2β)6,7, और intracellular कैल्शियम रिलीज1,8,9का मॉडुलन । सबूत जमते भी10,11,12,13के लिए एक निर्णायक जोखिम कारक के रूप में आनुवंशिक गड़बड़ी का पता चलता है । जीन पहचान इन उद्योग की गड़बड़ियों से संबंधित है, तथापि, मोटे तौर पर अनजान रहते हैं । Dexrazoxane केवल सहायक अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित के लिए उद्योग के इलाज के एजेंट है, लेकिन सीमित कार्यांवयन14,15,16के साथ, के लिए अतिरिक्त की पहचान की जरूरत स्कोरिंग चिकित्सीय रणनीतियों । उद्योग के पशु मॉडल है इसलिए इन प्रयोजनों के लिए पता लगाया । उनके पहुंच और सादगी के कारण, यंत्रवत मॉडल पर अध्ययन संभावित cardiomyopathies के अंय प्रकार पर व्यापक प्रभाव हो सकता है: आम रोगजनन अलग etiologies के cardiomyopathies के बीच साझा किया जा सकता है, विशेष रूप से बाद में रोग चरणों17,18,19,20.
इसके अलावा, उच्च प्रवाह के साथ zebrafish मॉडल उद्योग के मॉडल को कुतर दिया, दोनों नए आनुवंशिक कारकों और चिकित्सकीय की खोज की सुविधा के लिए विकसित किया गया है । एक भ्रूण उद्योग मॉडल चिकित्सीय यौगिकों21स्क्रीनिंग के लिए पारदर्शी zebrafish भ्रूण में स्थापित किया गया है । यह देखते हुए कि cardiomyopathies एक प्रगतिशील रोगजनन के साथ वयस्क शुरुआत रोग हैं, वयस्क zebrafish cardiomyopathy मॉडल22,23,24,25,26विकसित किया गया है । हम पुराने एनीमिया24से जिसके परिणामस्वरूप cardiomyopathy के लिए पहली बार अधिग्रहीत मॉडल उत्पंन, वयस्क zebrafish23में दूसरा अधिग्रहीत cardiomyopathy मॉडल के रूप में उद्योग के बाद । हमने पाया है कि एक एकल बोल्स के इंजेक्शन वयस्क zebrafish में cardiotoxicity कि एक तीव्र चरण के होते है लगभग 1 सप्ताह के बाद इंजेक्शन (wpi), cardiomyopathy की एक पुरानी चरण के बाद से 6 महीने के बाद इंजेक्शन । जबकि rapamycin(mtor) के यंत्रवत लक्ष्य की haploinsufficiency जीर्ण चरण में cardiomyopathy उंनति, यह तीव्र चरण में मछली मृत्यु दर अतिरंजित, वयस्क उद्योग मॉडल के मूल्य को रेखांकित करने के लिए विचार मंच पर निर्भर 23तंत्र । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि वयस्क उद्योग के मॉडल के लिए zebrafish संमिलन कार्डियक (ZIC) म्यूटेंट है कि एक transposon के माध्यम से उत्पंन किया जा रहा है के एक संग्रह में तनाव इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित सम्मिलनी mutagenesis दृष्टिकोण27। एक पायलट स्क्रीन की पहचान 3 ज्ञात cardiomyopathy जीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में DnaJ (Hsp40) homolog, उपपरिवार बी, और सदस्य घमण्ड (dnajb6b) नए उद्योग के रूप में झेलते जीन28। इसलिए, zebrafish में वयस्क उद्योग मॉडल की पीढ़ी के नेतृत्व में एक नई पद्धति है कि व्यवस्थित रूप से उद्योग के लिए आनुवंशिक संशोधक की पहचान सक्षम बनाता है, जो मौजूदा जीनोम व्यापक संघ अध्ययन (GWAS) और मात्रात्मक विशेषता लोकस पूरक (QTL विश्लेषण.
पीढ़ी और वयस्क zebrafish उद्योग मॉडल के कार्यांवयन के दौरान, हम विभिंन शोधकर्ताओं के बीच महत्वपूर्ण बदलाव देखा और/या यहां तक कि एक ही अंवेषक द्वारा प्रदर्शन अलग इंजेक्शन के बीच । मॉडल के अनुदैर्ध्य प्रकृति विभिंन जांचकर्ताओं से परिणाम दर्ज करने के लिए और अनुक्रमिक समस्या निवारण प्रक्रिया के लिए चुनौतियों लगाता है । अनुसंधान समुदाय द्वारा इस सरल cardiomyopathy उत्प्रेरण तनाव विधि के उपयोग की सुविधा के लिए, हम विस्तार से हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन, आईपी इंजेक्शन के दो प्रकार के वर्तमान, और विभिंन शोधकर्ताओं के बीच बदलाव को कम करने के लिए विचार पर चर्चा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रगतिशील उद्योग मॉडल के लिए, 20 मिलीग्राम/kg DOX की खुराक प्रयोग के रूप में सबसे अधिक खुराक है कि 1 wpi के दौरान महत्वपूर्ण मछली मौत का कारण नहीं है, लेकिन अभी भी मछली मौत और हृदय समारोह की कमी में परिणाम के रू…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन (14SDG18160021 YD) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अमेरिका NIH R01 अनुदान एचएल ८१७५३ और एचएल १०७३०४ xx, और मेयो xx के लिए फाउंडेशन ।
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
References
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy – putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
