معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد
Summary
التلوث أثناء تسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية لا يزال يمثل مشكلة كبيرة. هنا، نعرض طريقة لتسلسل الجينوم من تارديجرادي من عينة واحدة مع pg 50 أقل قدر من الحمض النووي دون تضخيم الجينوم كله التقليل من مخاطر التلوث.
Abstract
تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف ويمكن العودة إلى حالتها الأصلية عندما يتم توفير المياه. تسلسل الجينوم من الحيوانات المجهرية مثل تارديجراديس مخاطر التلوث البكتيري في بعض الأحيان يؤدي إلى تفسيرات خاطئة، على سبيل المثال، فيما يتعلق بمدى نقل الجينات الأفقي في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم أسلوب إدخال معالجات تسلسل جينوم تارديجرادي، دوجارديني هيبسيبيوس، من عينة واحدة. عن طريق استخدام الاستبعاد الغسيل والتلويث صرامة جنبا إلى جنب مع كفاءة استخراج من 50 ~ 200 pg المجينية الحمض النووي من فرد واحد، ونحن شيدت مكتبة التسلسل مع أداة تسلسل الحمض النووي. هذه المكتبات تم استنساخه للغاية وغير منحازة، وأظهر تحليل المعلوماتية من يقرأ التسلسل مع مورثات أخرى H. دوجارديني الحد أدنى من التلوث. يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى ايضات تارديجراديس التي يمكن أن لا تكون متسلسلة باستخدام الطرق السابقة.
Introduction
تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي يمكن أن تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف. أنها استعادة بامتصاص المياه1،2. في حالة أميتابوليك، تارديجراديس قادرة على التغاضي عن مختلف البيئات المتطرفة، التي تشمل درجات الحرارة القصوى3 والضغوط4،5، وجرعة عالية من الضوء فوق البنفسجي6والأشعة السينية وأشعة غاما 7 , 8و9من الفضاء الكوني. بيانات الجينوم أساس لا غنى عنه لدراسة الآليات الجزيئية أنهيدروبيوسيس.
المحاولات السابقة لتسلسل جينوم تارديجراديس أظهرت علامات التلوث البكتيري10،11،12،،من1314. تسلسل الجينوم من هذه الكائنات الصغيرة يتطلب عدد كبير من الحيوانات، وهو عرضه للتلوث البكتيري؛ ولذلك، فقد أنشأنا سابقا بروتوكول تسلسل باستخدام أسلوب إدخال معالجات بدءاً من عينة واحدة من تارديجرادي، للتقليل من مخاطر التلوث15. باستخدام هذه البيانات، كما أجرينا resequencing عالية الجودة وإعادة التجميع للجينوم من16، H. دوجارديني17. هنا نحن تصف بالتفصيل هذا الأسلوب لتسلسل الجينوم من فرد واحد تارديجرادي (الشكل 1). التحقق من الصحة لهذا الأسلوب التسلسل هو أبعد من التركيز في هذه الورقة، وسبق مناقشة مستفيضة في أعمالنا السابقة التقرير16.
ويتكون هذا الأسلوب من جزأين: عزل تارديجرادي واحد مع أدنى ممكن التلوث، واستخراج عالية الجودة للرسم التخطيطي مستويات الحمض النووي. Tardigrade جوعاً وتشطف جيدا مع الماء، فضلا عن المضادات الحيوية، ولاحظ تحت مجهر مع 500 X التكبير لضمان إزالة أي تلوث جرثومي. وتظهر التقديرات السابقة والقياسات أن فرد واحد من تارديجرادي يحتوي على حوالي 50-200 pg المجينية الحمض الخلوي الصبغي16، الذي يستخرج من تكسير الهيكل الخارجي كيتين بدورات تجميد أذاب أو بواسطة التذويب اليدوي. هذا الحمض النووي هو المقدمة لبناء مكتبة ومتسلسلة على أداة تسلسل الحمض النووي. ويبين تحليل المعلوماتية إضافية تسلسل عالية الجودة، فضلا عن تدني مستويات التلوث بالمقارنة مع المشاريع السابقة في تسلسل تارديجرادي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التلوث البكتيري يشكل تهديدا لتسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية. بينما قد تخرج الدراسات السابقة في تسلسل الجينوم تارديجرادي التلوث باستخدام أساليب المعلوماتية الواسعة12،20، نحن تسلسل الجينوم من فرد واحد التقليل من مخاطر التلوث. حيث يحتوي على حوالي 50-200 p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون تاكاي يوكي أبي نوزومي وايشي وناهوكو لدعمها التقني في تسلسل الجينوم. هذا العمل وأيده معونات “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) زميل أبحاث ومعونات كاكينهي “العلماء الشباب” (No.22681029)، ومعونات كاكينهي للبحوث العلمية (ب) رقم 17 ح 03620 من JSPS، منحة “مشاريع بحوث العلوم الأساسية” من مؤسسة سوميتومو (No.140340)، وجزئياً من أموال البحث من حكومة محافظة ياماجاتا ومدينة تسروكا، اليابان. وزودت chlorella الشائع استخدامها لتغذية تارديجراديس المجاملة Chlorella المحدودة للصناعة
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
