בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים
Summary
כאן, אנו מתארים את ניתוקה של המעית-גלייה מ המעי-submucosa באמצעות incubations EDTA רציפים כדי chelate קטיונים דו ערכיים ולאחר מכן הדגירה ב פתרון שחזור תאים שאינם אנזימטיות. ציפוי התליה תא תוצאות על פולי-D-ליזין ו- laminin תוצאות בתרבות מועשר של תאי גליה submucosal לניתוח פונקציונלי.
Abstract
מערכת העצבים המעית (ENS) מורכב נוירונים, תאי גליה המעית (EGCs) הנמצאים בתוך שריר חלק מהקיר, submucosa וכן פרופריה. מוסקולריס. EGCs תפקיד חשוב הומאוסטזיס הבטן דרך שחרורו של גורמים שונים עם מחלות ולתרום השלמות של המכשול אפיתל. רוב המחקרים של תרבויות גליה המעית ראשי להשתמש בתאים מבודד של מקלעת myenteric לאחר דיסוציאציה אנזימטיות. . הנה, מתוארת שיטה שאינה אנזימטי לבודד, תרבות EGCs מן submucosa מעיים פרופריה. מוסקולריס. לאחר הסרה ידנית של שכבת שרירים אורכיים, EGCs היו שוחררה מן פרופריה. מוסקולריס submucosa באמצעות incubations EDTA באגירה HEPES רציפים ואחריו הדגירה ב פתרון שחזור תא הלא-אנזימטי זמינים מסחרית. Incubations EDTA הספיקו להתפשט רוב רירית אפיתל מ פרופריה. מוסקולריס ומאפשר את פתרון שחזור התא לשחרר את EGCs submucosal. כל שיורית פרופריה. מוסקולריס, שריר חלק גורש יחד עם עכשיו, דונלד myenteric. EGCs אותרו בקלות על ידי היכולת שלהם לבטא גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP). רק כ- 50% של התליה תא הכילה GFAP + תאים לאחר השלמת רקמות incubations ולפני ציפוי על המצע פולי-D-ליזין/laminin. עם זאת, לאחר 3 ימים של culturing תאי גליה neurotrophic תא-derived factor (GDNF)-המכיל תרבות המדיה, האוכלוסייה תא הקפדה על הלוחות מצופים המצע מורכבת > עכשיו, דונלד המעית 95%. יצרנו קו העכבר היברידית על ידי גידול עכבר hGFAP-Cre לקו כתב רוזה-tdTomato כדי לעקוב אחר האחוז של GFAP + תאים באמצעות קרינה פלואורסצנטית תא אנדוגני. לכן, עכשיו, דונלד המעית הלא-myenteric יכול להיות מבודדת על ידי שיטות שאינן אנזימטי ותרבותית למשך 5 ימים לפחות.
Introduction
עניין תפקוד תאי גליה המעית (EGCs) עלה בהתמדה עקב תפקידיהם מוכרת הבטן הומאוסטזיס של תקינות1,2. בנוסף, EGCs משתנים לפי המיקום שלהן לאורכו של GI בדרכי3,4. EGCs שחרר גורמים עם מחלות שונות, כולל גליה neurotrophic תא-derived factor (GDNF), לתרום בטן תנועתיות1,5 ולהגיב תוצרי לוואי מיקרוביאלי6,7. מחקרים הראו כי האוכלוסייה EGC היא הטרוגנית, כי תפקידם משתנה בהתאם אם הם submucosal או לשכון ב- the1,פלקסוס myenteric7. לדוגמה, EGCs בתוך submucosa לתרום צמתי צר8. מחלת פרקינסון, רומז שלהם קשר אפשרי פנוטיפ הבטן של הפרעה זו9היו קשורים דיפרנציאלי GFAP וביטוי זרחון במצב EGCs. . לאחרונה, זה היה ציין כי אובדן גברים חלבון גרעיני בתרבויות מבודד של EGCs מ- submucosa מעיים הפרוקסימלית היה מספיק כדי לגרום ביטוי של הורמון גסטרין10. כתוצאה מכך, הוצע כי EGCs עשוי להיות המקור של gastrinomas תריסריון, סוג של גידולים נוירואנדוקריניים10. באופן קולקטיבי, דוגמאות אלה מדגישים את הרלוונטיות של הלומדים את ההתנהגות והתפקוד של EGCs מבודדים הפרעות נאורופתיות ו סרטן11.
האתגר בשדה נשאר כיצד לבודד ולימודים או שניהם EGC אוכלוסיות במבחנה. השושלת מעקב ניסויים הראו כי EGCs submucosa, פרופריה. מוסקולריס שמקורם ובתאים מקלעת myenteric7. יש אמנם מספר פרוטוקולים בידוד שפורסמו זמין ליצירת תרביות של myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, לא במיוחד מטרות בידוד של האוכלוסייה EGC מוסקולריס submucosal/פרופריה. קיימים פרוטוקולים לבידוד EGC דוקא שילוב של ההפרדה מכני או את microdissection של שריר חלק בשילוב עם דיסוציאציה אנזימטיות, בסופו של דבר השמטת את שכבת תאי הרירית.
המטרה של כתב יד זה היא להדגים את השלבים לבודד שאינם enzymatically EGCs העיקרי של פרופריה. מוסקולריס ללימודי במבחנה . כיוון שיש אין סמני המבדילות באופן ספציפי myenteric EGCs מאלו submucosa, ההפרדה המרחבי של רירית אפיתל של שריר חלק נוצלה כדי לבודד submucosal EGCs. בנוסף, על ידי שילוב קלאציה EDTA עם דיסוציאציה אנזימטי, EGCs הם בודדו אותנו מהמתרחש submucosa בניגוד שריר חלק, אשר גורש יחד עם EGCs המשויך אינטר-myenteric. הפרדה נוספת של submucosa ושל EGCs פרופריה. מוסקולריס אירעה מאת culturing התאים על מצעים ידידותי תא גליה, למשל, פולי-D-ליזין ו- laminin.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs תפקיד חשוב הומאוסטזיס הבטן, זה חיוני כדי לבודד וללמוד אותם בתוך חוץ גופית. ב פרוטוקול זה, שיטה פשוטה עבור בידוד EGCs מ פרופריה. מוסקולריס של המעי העכבר למבוגרים הוצג ללמוד המעית פונקציה גליה.
הסרת מצע המעי חסיד של LMMP באמצעות מקלון צמר גפן מסיר חלק אינטר-myenteric עכשיו, דונל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מאחלים לקבל תמיכה R37 DK045729 (כדי! לכל הרוחות), R01 AR060837 (כדי HX), של אוניברסיטת מישיגן מערכת העיכול מחקר מרכז מולקולרית הליבה P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
