Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon
Summary
Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.
Abstract
Nöronlar ve düz kas duvar, submukoza ve lamina propria içinde bulunan enterik Gliyal hücreler (EGCs) enterik sinir sistemi (ENS) oluşur. EGCs gut homeostazı çeşitli trofik faktörler sürümü ile önemli rol oynarlar ve epitel bariyer bütünlüğünü katkıda bulunmak. Birincil enterik gliyal kültürlerin en çalışmaları myenteric pleksus sonra enzimatik ayrılma izole hücreler kullanın. Burada, ayırmak ve bağırsak submukoza ve lamina propria EGCs kültür enzimatik olmayan bir yöntemi açıklanmıştır. Sonra el kaldırma boyuna kas tabakasının EGCs lamina propria ve piyasada bulunan enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka ardından sıralı HEPES tampon EDTA incubations kullanarak submukoza kurtarılmış. EDTA incubations gelen submucosal EGCs kurtarmak hücre kurtarma çözümü sağlayan lamina propria epitelyal mukoza çoğunu şerit yeterliydi. Herhangi bir kalıntı lamina propria ve düz kas myenteric glia birlikte atılır. EGCs kolayca gliyal fibrillary asidik protein (GFAP’nin) hızlı yeteneğini tarafından tespit edilmiştir. Hücre süspansiyon sadece yaklaşık % 50 GFAP’nin + hücrelerin doku incubations tamamladıktan sonra ve poli-D-lizin/laminin substrat üzerine kaplama öncesi bulunan. Ancak, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) hücre kültürü çalışmalarının 3 gün sonra-oluşan yüzey kaplamalı plakalar kalarak hücre nüfus kültür ortamı içeren, > % 95 enterik glia. Biz bir melez fare çizgi hGFAP-Cre fare endojen hücre floresans kullanarak GFAP’nin + hücre yüzdesini izlemek için ROSA-tdTomato muhabir hattına ıslahı tarafından oluşturdu. Böylece, myenteric enterik glia enzimatik olmayan yöntemlerle izole ve en az 5 gün için kültürlü.
Introduction
Enterik Gliyal hücreler (EGCs) fonksiyonu ilgi giderek tanınan rolleri olarak gut bütünlüğü ve homeostasis1,2nedeniyle artmıştır. Buna ek olarak, EGCs GI yolu3,4uzunluğu boyunca konumlarına göre değişiklik gösterir. EGCs, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) de dahil olmak üzere çeşitli trofik faktörler bırakın hareketliliği1,5 delik deşik ve mikrobiyal yan6,7‘ ye yanıt vermek için katkıda bulunmak. Çalışmalar EGC nüfus türdeş olmayan ve işlevlerine onlar submucosal veya myenteric pleksus1,7içinde bulunan bağlı olarak değişir belirttiler. Örneğin, EGCs submukoza içinde sıkı kavşak8‘ e katkıda bulunur. Diferansiyel GFAP’nin ifade ve EGCs fosforilasyon Parkinson hastaligi, gut fenotip Bu bozukluk9olası onların bağlantı telkin için bağlantılı olmuştur. Son zamanlarda, nükleer protein menin EGCs izole kültürlerin proksimal bağırsak submukoza üzerinden kaybı hormon gastrin10ifade ikna etmek yeterli görülmüştür. Sonuç olarak, EGCs duodenal gastrinomas, nöroendokrin tümör10türü kökeni olabilir önerildi. Toplu olarak, bu örnekler nöropatik bozuklukları ve kanser11izole EGCs işlevini ve davranış eğitimi alaka altını çiziyor.
Alan mücadelesine nasıl yalıtmak ve birini veya her ikisini EGC nüfus vitroçalışma kalır. Soy izleme deneyleri EGCs submukoza ve lamina propria progenitör hücre myenteric pleksus7kaynaklanan gösterdi. Birkaç yayımlanmış yalıtım protokol myenteric EGCs12,13,14,15,16,17kültürleri oluşturmaya uygun olmakla birlikte, 18,19, hiçbiri özellikle yalıtım submucosal/lamina propria EGC nüfusunun hedefleyen. Varolan iletişim kuralları EGC yalıtım için özellikle bir arada mekanik ayrılması veya sonunda mukozal hücre katmanı atarak enzimatik ayrılma ile birlikte düz kas mikrodiseksiyon kullanır.
Bu el yazması non-enzimatik lamina propria vitro çalışmalar için gelen birincil EGCs yalıtmak için adımları göstermek için hedeftir. Özellikle myenteric EGCs ayırt alanındaki bu submukoza hiçbir işaretleri olduğundan, düz kas kayma ayrılması epitel Fibromu submucosal EGCs yalıtmak için istismar edildi. Buna ek olarak, EDTA şelasyon enzimatik olmayan ayrılma ile birleştirerek, EGCs ilişkili Inter-myenteric EGCs ile birlikte atıldı düz kas aksine submukoza yalıtılmış. Submukoza ve lamina propria EGCs daha fazla ayrılması gliyal cep dostu yüzeylerde, Örneğin, poli-D-lizin ve laminin hücre kültürü çalışmalarının tarafından oluştu.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs gut homeostazı önemli rol oynarlar ve yalıtmak ve onları içinde vitroçalışma için önemlidir. Bu protokol için EGCs yetişkin fare bağırsak lamina propria izole için basit bir yöntem enterik gliyal işlev eğitim için kullanılmaya başlandı.
Yapisan bıçaklanmasından ve LMMP ile bir pamuklu çubukla kaldırma bazı boyuna ve dairesel kas arasında ikamet eden Inter-myenteric glia ortadan kaldırır, arabellek submucosal yüzeye erişilebilirliğini artırır ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar R37 DK045729 (JLM için) R01 AR060837 (için HX) ve University of Michigan Gastrointestinal araştırma merkezi moleküler çekirdek P30 DK034933 destek kabul etmek istiyorum.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
