הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה
Summary
אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.
Abstract
מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יקרים מאוד בגילוי הרומן ביולוגי תובנות החניכה, התקדמות מנגנוני מחלות אנושיות כגון סרטן. העכברים הטרנסגניים, מותנה נוקאאוט שימשו לעיתים קרובות ביטוי גנים או אבלציה רקמות ספציפיות או תא סוגי בתוך vivo. עם זאת, יצירת מודלים העכבר germline יכול להיות זמן רב ויקרות. הפיתוחים האחרונים בתחום הגן עריכה טכנולוגיות ואת הכדאיות של אספקת פלסמידים DNA על ידי זיהום ויראלי אפשרו דור מהירה של הלא-germline autochthonous העכבר סרטן מודלים עבור מספר איברים. שלפוחית השתן הוא איבר זה היה קשה עבור וקטורים ויראלית לגשת, בשל נוכחותם של שכבה גליקוזאמינוגליקן המכסים את urothelium. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדת לאספקה יעילה של ה-DNA פלסמידים לתוך העכבר שלפוחית השתן urothelium vivo בתוך. דרך intravesical החדרה של pCAG-GFP דנ א פלסמיד אלקטרופורציה השלפוחית בניתוח חשוף, אנו מראים כי פלסמיד דנ א יכולה להיות מועברת במיוחד לתוך התאים urothelial שלפוחית השתן לביטוי ארעית. השיטה שלנו מספק דרך נוחה ומהירה ביטוי נוקאאוט של גנים בשלפוחית עכבר, ניתן להחיל על בניין GEMMs של סרטן שלפוחית השתן ומחלות אורולוגיים אחרים.
Introduction
מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יש משחק תפקיד חיוני בהרחבת הידע שלנו על בעלי חיים, ג’ין פונקציות ויווופיתוח מנגנוני המחלה התקדמות1,2. Germline GEMMs מפותחים באופן מסורתי בשתי דרכים. הראשונה היא היצירה של העכברים הטרנסגניים בזריקה pronuclear של הדנ א פלסמיד ואחריו את השתלת של מופרות לתוך נקבות pseudopregnant. השני הוא הדור של עכברים טוק-אאוט/טוק-in על-ידי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים לבין התפתחות כימרות. נוקאאוט מותנה של גנים ספציפיים ברקמות או תא סוג עניין כרוך הרבייה של אללים מהונדסים עם Cre ואתרים flox דורות מרובים. כל התהליך יכול להיות יקר ולא זמן רב, במיוחד אם המטרה היא היעד גנים מרובים רקמות-במיוחד. לאחרונה, עריכת ג’ין טכנולוגיות כגון באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) הוחלו על מספר איברים של העכברים לזירוז רקמות ספציפיות שינויים גנטיים לסרטן autochthonous מידול3, 4,5,6,7 או מוטציות המחלה הנכונה בחיי עיר8,9. במחקרים אלה, המסירה של הווקטורים gRNA הושג בדרך כלל דרך זיהום adenoviral או lentiviral של האיבר או הזרקת וריד הזנב hydrodynamic. הקלות היחסית משלוח של הרכיבים CRISPR ריאות ולכבד השתפרה במידה את הנוחות והיעילות של סרטן מידול באיברים אלה לעומת הדגמים העכבר Cre-לקס המבוסס מסורתית.
Urothelium שלפוחית השתן היא איפה שמקורן רוב גידולים בשלפוחית השתן. המשלוח של ה-DNA וקטורים שלפוחית השתן urothelium לטיפול דוגמנות או ג’ין סרטן היא הקשו על ידי שכבה גליקוזאמינוגליקן על פני השטח urothelial הפסגה, אשר משמש כמחסום ב”זכות של הווירוסים זיהומיות10,11. מספר סוכנים pretreatment כגון Syn3 ו- dodecyl-β-d-maltoside שימשו כדי לשבש את מחסום זה ולשפר אדנו זיהום יעילות12,13,14. אם adeno-הקשורים וירוסים (AAVs) יכול להדביק ביעילות שלפוחית השתן לא דווחה. בסך הכל, שיטת משלוח מבוסס נגיפי יהיה רצוי. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדה למסירה יעיל דנ א פלסמיד urothelium העכבר דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. כי הגישה שלנו אינו כרוך רעלני כימי של השכבה גליקוזאמינוגליקן או וירוס הייצור, שזה משמעותי מפשט את המסירה של ה-DNA פלסמידים לתוך urothelium שלפוחית השתן העכבר, צריך להקל על מחקרים שונים אין ויוו מחלות שלפוחית השתן.
Protocol
Representative Results
Discussion
אלקטרופורציה משפר את חדירות קרום התא, טכנולוגיה רבת עוצמה עבור ג’ין electrotransfer16. המסירה הגן לתוך החיים מכרסמים מאת אלקטרופורציה שימש לעתים קרובות נוירוביולוגיה שדות17,18,19,20,21. שלה יישומים א?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים חן סל פרופסור דוקטור יואה ג’אנג, Kendy הואנג לקבלת עזרה בהתקנת מערכת אלקטרופורציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן סנטה קרוז סרטן לטובת קבוצה NIH Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
