電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法
Summary
マウス膀胱の生体内で尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによる尿路上皮細胞への DNA のプラスミッドの配信手法について述べる.膀胱疾患の土着のマウス ・ モデルを生成するための迅速かつ便利な方法を提供しています。
Abstract
遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、癌などの人間の病気の開始そして進行のメカニズムを生物学的知見を明らかに非常に貴重です。遺伝子発現形質転換および条件付きノックアウト マウスが頻繁に使用されているまたは特定のティッシュかセルでアブレーション タイプの生体。ただし、生殖マウス モデルの生成は、時間がかかり、高価にすることができます。遺伝子編集技術及びウイルス感染によってプラスミド DNA を提供することの実現可能性の最近の進歩は、いくつかの臓器の非生殖土着マウス癌モデルの急速な生成を有効にしています。膀胱は、ウイルスベクター尿路を覆うグリコサミノグリカン層の存在のために、アクセスするは難しいされている器官です。ここでは、マウス膀胱尿路上皮の体内に DNA プラスミドの効率的な配信のためのラボで開発された手法について述べる.PCAG GFP プラスミドの膀胱内注入および外科的露出膀胱のエレクトロポレーション、膀胱尿路上皮細胞一過性発現のために具体的には DNA のプラスミッドを配信できることを示す.本手法は過剰発現とマウス膀胱における遺伝子のノックダウンのため迅速かつ便利な方法を提供します、膀胱がんや他の泌尿器科疾患の GEMMs を構築に適用することができます。
Introduction
遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、動物の開発、遺伝子機能生体内、および疾患進行1,2メカニズムに関する知識の拡大に重要な役割を演奏されています。生殖 GEMMs は伝統的に 2 つの方法で開発されています。最初の偽妊娠女性に受精卵移植による続く DNA のプラスミッドの前核注入によるトランスジェニック マウスの作成です。他のアウト/ノックアウト ・ ノックイン マウス胚性幹細胞での相同組み換えによる生成とキメラの開発です。興味の特定の組織や細胞の種類の遺伝子のノックアウト条件付きにはには、複数世代の Cre、flox のサイトと遺伝子組み換え遺伝子の繁殖が含まれます。全体のプロセスが高価な目標は、組織に複数の遺伝子を対象とする場合は特に、時間のかかることができます。最近では、クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの遺伝子編集技術はモデリング3、土着の癌組織特異遺伝子変異を誘導するマウスの複数の器官に適用されています。 4,5,6,7または8,9その場で正しい病気の突然変異。これらの研究では、gRNA ベクトル配信通常器官または流体の尾静脈注射のアデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染によって達成されました。利便性と癌の伝統的な Cre Lox 基づくマウス モデルと比較してこれらの器官のモデリングの効率、肺と肝臓への CRISPR コンポーネントの配信の相対的な容易さが大幅に向上します。
膀胱尿路上皮はほとんど膀胱腫瘍が発生します。膀胱尿路上皮癌モデリングや遺伝子治療への DNA ベクターの配信は、ウイルス感染の10、11の付着のための障壁として機能する頂尿路上皮表面にグリコサミノグリカン層によって妨げられています。Syn3 などドデシル-β-d-maltoside いくつかの前処理剤は、この障壁を破壊し、アデノ ウイルス感染効率12,13,14を高めるために使用されています。アデノ随伴ウイルス (通気) することができます効果的に膀胱に感染するかどうかは報告されていません。全体的にみて、非ウイルス性に基づいて配信方法が望ましいでしょう。ここでは、尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによるマウス尿路への効率的な DNA プラスミド配信のラボで開発手法について述べる.我々 のアプローチは、グリコサミノグリカン レイヤーまたはウイルス産生の化学的前処理を含まない、それ自体が大幅 DNA プラスミドのマウス膀胱尿路への導入を簡略化し、様々 な体内調査を促進する必要があります。膀胱疾患。
Protocol
Representative Results
Discussion
エレクトロポレーションは細胞膜透過性を高め、遺伝子電子伝達系16のための強力な技術です。電気穿孔法による生活を齧歯動物への遺伝子導入は神経生物学分野17,18,19,20,21によく使用されています。他の多くの器官の潜在的な応用は広範囲にわたって?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エレクトロポレーション システムのセットアップのヘルプ、箱陳教授、博士越張とケンディ ホアンに感謝します。この作品は、Z.A.W. にサンタ ・ クルスがん給付グループと NIH からの補助金によって支えられました。
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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