أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر
Summary
يصف لنا طريقة جديدة لإيصال بلازميد الحمض النووي في خلايا urothelial الماوس المثانة في فيفو عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. يوفر طريقة سريعة وملائمة لتوليد نماذج الماوس أصلي من أمراض المثانة.
Abstract
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) قيمة للغاية في الكشف عن رواية رؤى البيولوجية في آليات بدء وتطور البشرية من الأمراض مثل السرطان. الفئران المحورة وراثيا والشرطي بالضربة القاضية قد استخدمت مرارا ل overexpression الجينات أو الاجتثاث في أنسجة محددة أو الخلية أنواع فيفو. ومع ذلك، يمكن توليد نماذج الماوس germline تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. ومكنت التطورات الأخيرة في تحرير تكنولوجيات وجدوى توفير والبلازميدات الحمض النووي من خلال العدوى الفيروسية الجينات السريع توليد نماذج سرطان الماوس أصلي غير germline للعديد من الأجهزة. المثانة هو جهاز الذي كان من الصعب لناقلات الأمراض الفيروسية للوصول، بسبب وجود طبقة glycosaminoglycan تغطي أوروثيليوم. هنا، يمكننا وصف طريقة جديدة وضعت في مختبر لتقديم والبلازميدات الحمض النووي بشكل فعال في أوروثيليوم المثانة الماوس في فيفو. عن طريق تقطير إينترافيسيكال من بلازميد الدنا بكاج-التجارة والنقل وانهانسر من المثانة جراحيا المكشوفة، نظهر أن يمكن تسليمها بلازميد الحمض النووي على وجه التحديد إلى الخلايا urothelial المثانة لتعبير عابر. لدينا أسلوب يوفر طريقة سريعة وملائمة أوفيريكسبريشن وضربه قاضية للجينات في المثانة الماوس، ويمكن تطبيقها على بناء جيمس سرطان المثانة وغيرها من أمراض الجهاز البولي.
Introduction
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تضطلع بدور أساسي في توسيع معارفنا حول التنمية الحيوانية والجينات وظائفها في فيفو، وآليات المرض التقدم1،2. وتوضع جيمس Germline تقليديا بطريقتين. الأول هو إنشاء الفئران المعدلة وراثيا عن طريق الحقن برونوكليار من الحمض النووي بلازميد متبوعاً بزرع zygotes في الإناث بسيودوبريجنانت. والآخر هو توليد تدق-/نوك-في الفئران باقترانها مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية ووضع التركيبات. الشرطي بالضربة القاضية للجينات في نوع النسيج أو الخلية المحددة لمصلحة ينطوي على تربية الآليلات المهندسة وراثيا مع لجنة المساواة العرقية وفلكس مواقع لأجيال متعددة. العملية كلها يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، لا سيما إذا كان الهدف لاستهداف جينات متعددة الأنسجة على وجه التحديد. مؤخرا، طبقت تكنولوجيات تحرير الجينات مثل مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) على عدة أجهزة من الفئران للحث على التعديلات الخاصة بالانسجة الوراثية للسرطان أصلي النمذجة3، 4،5،،من67 أو الطفرات المرض الصحيح في الموقع8،9. في هذه الدراسات، تم تسليم ناقلات جرنة عادة عن طريق العدوى أدينوفيرال أو لينتيفيرال للجهاز أو حقن الوريد ذيل هيدرودينامية. والسهولة النسبية لتوصيل المكونات كريسبر إلى الرئتين والكبد تحسنت كثيرا الراحة والكفاءة للسرطان النمذجة في هذه الأجهزة مقارنة بنماذج الماوس Cre-لوكس أساس التقليدية.
أوروثيليوم المثانة حيث تنشأ معظم أورام المثانة. طبقة جليكوسامينوجليكان على سطح urothelial قمي، الذي يعمل كحاجز للانضمام للفيروسات المعدية10،11يعوق تسليم ناقلات الحمض النووي إلى urothelium المثانة لعلاج السرطان النمذجة أو الجينات. استخدمت عدة عوامل المعالجة مثل Syn3 ودوديسيل-β-د-مالتوسيدي لتعطيل هذا الحاجز وتعزيز إتش العدوى الكفاءة12،،من1314. ما إذا كانت الفيروسات المرتبطة بالغدة (آفس) يمكن أن تصيب فعالية المثانة قد لا أفيد. وعموما، سيكون من المستصوب أسلوب تسليم على أساس غير فيروسية. وهنا يصف لنا طريقة جديدة وضعت في مختبر لكفاءة تقديم بلازميد الحمض النووي ل urothelium الماوس عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. لنهجنا لا تنطوي على المعالجة الكيميائية لطبقة جليكوسامينوجليكان أو إنتاج الفيروس، فإنه إلى حد كبير يبسط إيصال والبلازميدات الحمض النووي في أوروثيليوم المثانة الماوس، وينبغي تسهيل الدراسات المختلفة في فيفو أمراض المثانة.
Protocol
Representative Results
Discussion
انهانسر يعزز نفاذية غشاء الخلية، وهو عبارة عن تقنية قوية للجينات اليكتروترانسفير16. إيصال الجينات إلى القوارض الحية التي انهانسر قد استخدمت كثيرا في بيولوجيا الأعصاب الحقول17،،من1819،،من2021</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الأستاذ بن تشن والدكتور تشانغ يو هوانغ كندي للمساعدة في إعداد نظام انهانسر. أيد هذا العمل منح من سانتا كروز السرطان مجموعة المزايا والمعاهد الوطنية للصحة إلى Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
