Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation
Summary
Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.
Abstract
Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) zijn uiterst waardevol in onthullende roman biologische inzicht in de mechanismen van het initiatie en de vooruitgang van menselijke ziekten zoals kanker. Transgene en voorwaardelijke knock-out muizen zijn vaak gebruikt voor gene overexpressie of ablatie in specifieke weefsels of cel typt in vivo. Genereren van germline Muismodellen kan echter tijdrovend en kostbaar. Recente vooruitgang in de gene bewerken van technologieën en de haalbaarheid van het leveren van DNA-plasmiden door virale infectie hebt ingeschakeld snelle generatie niet-germline autochtoon Muismodellen kanker voor verscheidene organen. De blaas is een orgaan dat is moeilijk voor virale vectoren te openen, als gevolg van de aanwezigheid van een glycosaminoglycaan laag die betrekking hebben op de urothelium geweest. Hier beschrijven we een nieuwe methode ontwikkeld in lab voor efficiënte levering van DNA-plasmiden in de muis blaas urothelium in vivo. Door intravesicale instillation van pCAG-GFP DNA plasmide en electroporation van chirurgisch blootgestelde blaas, laten we zien dat het DNA plasmide specifiek in de urothelial cellen van de blaas voor voorbijgaande expressie kan worden geleverd. Onze methode biedt een snelle en gemakkelijke manier voor overexpressie en knockdown van genen in de blaas van de muis, en kan worden toegepast op het opbouwen van GEMMs van blaaskanker en andere urologische aandoeningen.
Introduction
Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) hebt is spelen een essentiële rol bij de uitbreiding van onze kennis over dierlijke ontwikkeling, gene functies in vivo, en mechanismen van1,2van de progressie van de ziekte. Germline GEMMs zijn traditioneel ontwikkeld op twee manieren. De eerste is de oprichting van transgene muizen door pronuclear injectie van DNA plasmide gevolgd door transplantatie van zygoten in pseudopregnant vrouwtjes. Anderzijds is de generatie van knock-out/knock-in muizen door homologe recombinatie bij embryonale stamcellen en de ontwikkeling van chimaera. Voorwaardelijke knockout van genen in bepaalde weefsels of cellen soort belang houdt het kweken van genetisch gemanipuleerde allelen met Cre en flox sites voor meerdere generaties. Het hele proces kan worden duur en tijdrovend, vooral als het doel is om het weefsel-specifiek richten op meerdere genen. Onlangs, bewerken van gene technologieën zoals geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) zijn toegepast op de verschillende organen van de muizen voor het opwekken van weefsel-specifieke genetische wijzigingen voor autochtone kanker modellering van3, 4,5,6,7 of juiste ziekte mutaties in situ8,9. De levering van de vectoren van de gRNA werd in deze studies, meestal bereikt door adenovirale of lentivirale infectie van het orgaan of de hydrodynamische staart-veneuze injectie. Het relatieve gemak van levering van de componenten van de CRISPR naar de longen en de lever is sterk verbeterd het gemak en de efficiency van kanker modelleren in deze organen ten opzichte van de traditionele Muismodellen van Cre-Lox gebaseerd.
De urothelium van de blaas is waar de meeste tumoren van de blaas vandaan komen. De levering van DNA vectoren aan de urothelium van de blaas voor kankertherapie modeling of gen wordt belemmerd door een glycosaminoglycaan laag op het oppervlak van de apicale urothelial, die als een barrière voor de hechting van besmettelijke virussen10,11 fungeert. Verschillende voorbehandelingsplatformen agentia zoals Syn3 en dodecyl-β-d-maltoside zijn gebruikt om deze barrière te verstoren en adenovirus infectie efficiëntie12,13,14te verbeteren. Of adeno-geassocieerde virussen (AAVs) kunnen effectief het infecteren van de blaas is niet gemeld. Over het geheel genomen zou een niet-virale gebaseerde leveringswijze wenselijk zijn. Hier beschrijven we een nieuwe methode ontwikkeld in het lab voor efficiënte DNA plasmide levering aan de urothelium van de muis via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Omdat onze aanpak geen chemische voorbehandeling van de glycosaminoglycaan laag of virus productie vergt, het aanzienlijk vereenvoudigt de levering van DNA-plasmiden in de urothelium van de blaas muis en verschillende in vivo studies moet vergemakkelijken van ziekten van de blaas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroporation verhoogt de permeabiliteit van de celmembraan en is een krachtige technologie voor gene electrotransfer16. Gene levering in levende knaagdieren door electroporation is vaak gebruikt in de neurobiologie velden17,18,19,20,21. De potentiële toepassingen in vele andere organen hebben niet uitgebreid onderzocht. Om onze kenn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang en Kendy Hoang voor hulp bij het opzetten van het systeem electroporation. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Santa Cruz Cancer voordeel Group en NIH voor Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
