Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation
Summary
Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.
Abstract
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind sehr wertvoll bei der Enthüllung neuartige biologische Einblicke in die Initiierung und Progression Mechanismen der menschlichen Krankheiten wie Krebs. Transgenen und bedingte Knockout-Mäusen werden häufig seit Überexpression des Gens oder Ablation in bestimmten Geweben oder Zellen in Vivo-Typen. Generierung von Keimbahn Mausmodellen kann Zeit- und kostenaufwändige jedoch. Neue Zuführungen in gen Bearbeiten von Technologien und die Machbarkeit liefern DNA Plasmide durch Virusinfektion haben schnelle Generierung von nicht Keimbahn autochthonen Mausmodellen Krebs für mehrere Organe aktiviert. Die Blase ist ein Organ, das für virale Vektoren aufgrund des Vorhandenseins einer Glykosaminoglykan Schicht deckt das Urothel Zugang zu schwierig gewesen sei. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, entwickelt im Labor für die effiziente Bereitstellung von DNA Plasmide in der Maus Blase Urothel in Vivo. Durch die intravesikale Instillation von pCAG-GFP DNA Plasmid und Elektroporation chirurgisch freigelegten Blase zeigen wir, dass das Plasmid DNA spezifisch in die Blase important Zellen für transiente Expression geliefert werden kann. Unsere Methode bietet eine schnelle und bequeme Möglichkeit für Überexpression und Knockdown von Gene in der Maus Blase und zum Aufbau von GEMMs von Blasenkrebs und anderen urologischen Krankheiten angewendet werden kann.
Introduction
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Erweiterung unseres Wissens über TIERENTWICKLUNG, gen Funktionen in Vivound Mechanismen der Krankheit Fortschreiten1,2. Keimbahn GEMMs werden traditionell in zweierlei Hinsicht entwickelt. Die erste ist die Schaffung von transgenen Mäusen durch man Injektion von DNA Plasmid, gefolgt von der Transplantation von Zygoten in pseudopregnant Weibchen. Die andere ist die Generierung von Knock-Out/Knock-in Mäusen durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen und die Entwicklung der Chimären. Bedingte ko von Genen in bestimmten Geweben oder Zellen Art von Interesse gehört die Zucht von gentechnisch Allele mit Cre und Flox Standorten über mehrere Generationen. Der gesamte Prozess kann teuer und zeitaufwändig sein, besonders wenn das Ziel ist es, mehrere Gene Gewebe-gezielt. Vor kurzem haben mehrere Organe der Mäuse induzieren Gewebe-spezifische genetische Veränderungen für autochthone Krebs Modellierung3gen Bearbeitung Technologien wie gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) zugewiesen wurde, 4,5,6,7 oder richtige Krankheit Mutationen in Situ8,9. In diesen Studien wurde die Lieferung der gRNA Vektoren in der Regel durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion der Orgel oder hydrodynamischen Tail-Vein Injektion erreicht. Die relative Leichtigkeit der Lieferung der CRISPR-Komponenten auf die Lunge und Leber hat sich verbessert den Komfort und die Effizienz von Krebs in diesen Organen im Vergleich zu den traditionellen Cre-Lox-basierte Mausmodellen Modellierung.
Die Blase Urothel ist wo die meisten Blase Tumoren entstehen. Die Lieferung von DNA-Vektoren an der Blase Urothel für die Krebstherapie Modellierung oder gen scheitert an ein Glykosaminoglykan-Schicht auf der apikalen important Oberfläche fungiert als ein Hindernis für die Einhaltung von infektiösen Viren10,11. Mehrerer Vorbehandlung Agenten wie Syn3 und Dodecyl-β-d-maltosid wurden zur stören diese Barriere und Adenovirus-Infektion Effizienz12,13,14zu erhöhen. Ob Adeno-assoziierten Viren (Flugabwehrpanzer) effektiv die Blase infizieren können, wurde nicht berichtet. Alles in allem wäre eine nicht-viralen basierend Übermittlungsmethode wünschenswert. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die im Labor für effiziente DNA Plasmid-Lieferung an die Maus Urothel durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation entwickelt. Da unser Ansatz nicht chemische Vorbehandlung der Glykosaminoglykan-Schicht oder Virus Produktion involviert ist, es wesentlich vereinfacht die Bereitstellung von DNA Plasmide in der Maus Blase Urothel, und sollte erleichtern verschiedene in-Vivo -Studien Erkrankungen der Blase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporation verbessert die Durchlässigkeit der Zellmembran und ist eine leistungsstarke Technologie für gen-Electrotransfer-16. Gen-Lieferung in lebenden Nagetiere durch Elektroporation wurde häufig in der Neurobiologie Felder17,18,19,20,21verwendet. Seine Anwendungsmöglichkeiten in vielen anderen Organen haben nicht ausgiebig e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang und Kendy Hoang für Hilfe beim Einrichten der Elektroporation-System. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Santa Cruz Cancer nutzen Group und NIH, Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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