Romanen leveringsmåten plasmider DNA til musen blæren Urothelium av Electroporation
Summary
Vi beskriver en ny metode for levering av DNA plasmider inn i urothelial celler av musen blæren i vivo gjennom urinrøret catheterization og electroporation. Det tilbyr en rask og enkel måte for autochtonous musen modeller av blæren sykdommer.
Abstract
Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) er svært verdifull i avslørende romanen biologiske innsikt i initiering og progresjon mekanismer av menneskelige sykdommer som kreft. Transgene og betinget knockout mus er ofte brukt for gene overuttrykte eller ablasjon i bestemte vev eller cellen typer i vivo. Men kan germline musen modeller være tidkrevende og kostbare. Siste fremskritt i genet teknologier og muligheten for å levere DNA plasmider ved virusinfeksjon har aktivert rask generasjonen non-germline autochtonous musen kreft modeller for flere organer. Blæren er et organ som har vært vanskelig for viral vektorer til av et glycosaminoglycan lag som dekker urothelium. Her beskriver vi en ny metode utviklet i laboratoriet for effektiv levering av DNA plasmider i musen blæren urothelium i vivo. Gjennom intravesical instillasjon av pCAG-GFP DNA plasmider og electroporation av kirurgisk eksponert blæren viser vi at DNA plasmider leveres spesielt i blæren urothelial celler for forbigående uttrykk. Vår metode gir en rask og enkel måte for overuttrykte og knockdown av gener i musen blæren, og kan brukes til å bygge GEMMs for blærekreft og andre Urologiske sykdommer.
Introduction
Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) har spilt en viktig rolle i å utvide vår kunnskap om animalske utvikling, gene funksjoner i vivoog mekanismer for sykdom progresjon1,2. Germline GEMMs er tradisjonelt utviklet på to måter. Først er etableringen av transgene mus ved pronuclear injeksjon av DNA plasmider etterfulgt av transplantasjon av zygotes i pseudopregnant kvinner. Den andre er generasjonen av knock-out/knock-i mus av homologe rekombinasjon i embryonale stamceller og utvikling av chimeras. Betinget knockout av gener i bestemte vev eller celle type interesse innebærer oppdrett av genmodifiserte alleler med grobunn og flox i flere generasjoner. Hele prosessen kan være dyrt og tidkrevende, særlig hvis målet er å målrette flere gener vev-spesielt. Nylig, gen-redigering teknologier som gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) er brukt på flere organer av mus å indusere vev-spesifikke genetiske endringer for autochtonous kreft modellering3, 4,5,6,7 eller riktig sykdom mutasjoner i situ8,9. I disse studiene, var levering av gRNA vektorer vanligvis oppnås gjennom adenoviral eller lentiviral infeksjoner av orgel eller etter halen blodåre injeksjon. Det er relative enkelt for levering av CRISPR komponenter til lunge og lever har kraftig forbedret bekvemmeligheten og effektiviteten av kreft modellering i disse organene sammenlignet med de tradisjonelle grobunn-Lox basert musen modellene.
Blæren urothelium er der de fleste blæren svulster stammer. Levering av DNA vektorer til blære urothelium for kreft modellering eller gene terapi er hindret av et glycosaminoglycan på apikale urothelial overflaten, som fungerer som en barriere for tilslutning smittsomme virus10,11. Flere forbehandling agenter som Syn3 og dodecyl-β-d-maltoside har blitt brukt til å avbryte denne barrieren og forbedre adenovirus, infeksjon, effektivitet,12,,13,,14. Om adeno-assosiert virus (AAVs) effektivt kan infisere blæren er ikke rapportert. Overall, en ikke-viral basert leveringsmetode ville være ønskelig. Her beskriver vi en ny metode utviklet i laboratoriet for effektiv DNA plasmider levering til musen urothelium gjennom urinrøret catheterization og electroporation. Fordi vår tilnærming ikke innebærer kjemisk forbehandling av glycosaminoglycan laget eller virus produksjon, det betydelig forenkler levering av DNA plasmider i musen blæren urothelium, og skal lette ulike i vivo studier blæren sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroporation forbedrer cellemembranen permeabilitet og er en kraftig teknologi for gene electrotransfer16. Gen levering i levende gnagere av electroporation er ofte brukt i nevrobiologi felt17,18,19,20,21. Dens potensielle anvendelser i mange andre organer har ikke vært mye utforsket. Vi vet er våre metoden beskrevet her den først…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Professor Bin Chen og Dr. Yue Zhang Kendy Hoang for hjelp med electroporation systemet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Santa Cruz kreft nytte gruppe og NIH til Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
