Новый метод доставки ДНК плазмиды мыши Уротелий мочевого пузыря путем электропорации
Summary
Мы опишем новый метод для доставки плазмида ДНК в клетки мыши мочевого пузыря в естественных условиях через катетеризация уретры и электропорации urothelial. Она предлагает быстрый и удобный способ для генерации автохтонные мыши модели заболеваний мочевого пузыря.
Abstract
Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются чрезвычайно ценными в раскрытии Роман биологических проницательности в инициации и прогрессии механизмы заболеваний человека, таких как рак. Трансгенные и условного нокаут мышей часто использовались для гиперэкспрессия генов или абляции в определенных тканях или ячейка типы в естественных условиях. Однако создавая микрофлорой мыши модели может быть длительным и дорогостоящим. Последние достижения в гене редактирования технологии и возможности доставки ДНК плазмиды вирусной инфекции позволили быстрого поколения не микрофлорой автохтонные мыши рака модели для нескольких органов. Мочевого пузыря представляет собой орган, который был трудным для вирусных векторов для доступа благодаря наличию Глюкозаминогликан слой, покрывающий Уротелий. Здесь мы опишем новый метод разработан в лаборатории для эффективной доставки ДНК плазмиды в мыши мочевого пузыря Уротелий в vivo. Через внутрипузырной инстилляции плазмидной ДНК pCAG-GFP и электропорации хирургически подвергаются пузыря мы покажем, что плазмида ДНК могут быть доставлены специально в urothelial клетки мочевого пузыря для переходных выражения. Наш метод обеспечивает быстрый и удобный способ для гиперэкспрессия и сногсшибательно генов в мочевом пузыре мыши и может применяться для строительства GEMMs рака мочевого пузыря и других урологических заболеваний.
Introduction
Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) играют важную роль в расширении наших знаний о развития животных, Джин функций в естественных условияхи механизмы болезнь прогрессии1,2. GEMMs микрофлорой традиционно разрабатываются двумя способами. Во-первых, создание трансгенных мышей pronuclear инъекции плазмидной ДНК, после трансплантации зигот в pseudopregnant самок. Другой — поколение стук out/стучите в мышей, гомологичная рекомбинация в эмбриональных стволовых клеток и развитие химер. Условное нокаут генов в определенный тип ткани или клетки интерес включает разведения генетически аллели с КРР и flox сайтов для нескольких поколений. Весь процесс может быть дорогостоящим и трудоемким, особенно если цель ткани специально для нескольких генов. Недавно ген редактирования технологий, таких как кластеризованные регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) были применены к несколько органов мышей, чтобы вызвать генетические изменения ткани конкретных автохтонные рака, моделирование3, 4,5,6,7 или мутации правильный болезнью в situ8,9. В этих исследованиях доставки gRNA векторов обычно достигается через аденовирусных или лентивирусные инфекции органа или гидродинамические инъекции хвост Вену. Относительная легкость доставки ТРИФОСФАТЫ компонентов в легких и печени позволило значительно улучшить удобство и эффективность моделирования в этих органах, по сравнению с традиционными моделями мыши Cre-Lox основе раком.
Уротелий мочевого пузыря является, откуда поступает большинство опухолей мочевого пузыря. Глюкозаминогликан слой на поверхности апикальной urothelial, который действует как барьер для присоединения инфекционных вирусов10,11препятствует доставки ДНК векторов Уротелий мочевого пузыря для моделирования или генной терапии рака. Чтобы сорвать этот барьер и повышения аденовирусной инфекции эффективность12,,1314были использованы несколько предварительной обработки агентов, таких как Syn3 и додецил β-d-maltoside. Ли аденоассоциированный вирусов (AAVs) можно эффективно заразить мочевого пузыря не сообщалось. В целом желательно метод-вирусной основе доставки. Здесь мы опишем новый метод разработан в лаборатории для эффективной доставки плазмида ДНК Уротелий мыши через катетеризация уретры и электропорации. Потому что наш подход не предполагает химической предварительной Глюкозаминогликан слоя или вирус производства, он значительно упрощает доставку ДНК плазмиды в мыши Уротелий мочевого пузыря и должно способствовать различных в vivo исследований заболевания мочевого пузыря.
Protocol
Representative Results
Discussion
Электропорация повышает проницаемость клеточной мембраны и — это мощная технология для гена electrotransfer16. Джин доставки в жизни грызунов путем электропорации часто используются в нейробиологии поля17,18,19,,<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессор Бен Чэнь, д-р Чжан Юэ и Кенди Hoang за помощь в настройке системы электропорации. Эта работа была поддержана от грантов от Санта-Крус рак пособие группы и низ Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
